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主笔：于浩、赵书雪
注意事项
- 过氧化氢酶（catalase，CAT）的主要作用是催化过氧化氢分解为水和氧气，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御体系的关键酶之一，为机体提供了抗氧化防御机理。CAT是普遍存在于所有生物体内的一种抗氧化酶，是主要的抗氧化酶。过氧化氢酶是由四个多肽链组成的同源四聚体，每一个亚基含有超过500个氨基酸残基，且每个亚基的活性位点都含有一个卟啉血红素基团，用于催化过氧化氢的反应。过氧化氢酶的最适pH接近7。
- 过氧化氢酶催化的反应是使过氧化氢还原成水： 2H2O2=O2↑+ 2H2O
具体的反应方程式如下：
H2O2 + Fe(III)-E → H2O + O=Fe(IV)-E(.+)
H2O2 + O=Fe(IV)-E(.+) → H2O + Fe(III)-E + O2
- Catalase酶活测定就是检测H2O2的分解，H2O2在240 nm处的摩尔吸光系数为Ɛ240nm = 39.4 M-1cm-1，通过检测240 nm处吸光值的下降来计算Catalase的酶活。反应终浓度设置为10 mM，过高的过氧化氢（100 mM）会导致catalase失活。
- 加入每种试剂时都要换取新的枪头，防止污染试剂。清洗比色杯时一定要尽量倒净比色杯里面的蒸馏水。
一、实验准备
1、试剂
PBS缓冲液（用储藏液稀释，具体参考：常见溶液、缓冲液配制方法）
50 mM过氧化氢：（5×，用多少配多少）
H2O2是危险品无法随意购买，H2O2本身会分解，因此浓度通常与试剂瓶上面显示的不符，需要先根据摩尔吸光系数（Ɛ240nm = 39.4 M-1cm-1）（不同来源资料的Ɛ会有差别，但差异不大，对结果无影响）来进行浓度标定。50 mM的过氧化氢在240 nm处的吸光值应该是2.0，10 mM应该是0.4。标定后，根据需要测定的样品数量，配置50 mM的过氧化氢储藏液。
危险品使用需要严格遵守"用多少配多少"的原则!
2、仪器
紫外分光光度计，微量比色杯（狭缝4 mm，1.4 mL比色皿），离心机，组织研磨仪
二、测定CAT酶活
1、将0.1 g的生物样本加入到2 mL的研磨管中，加入1 mL PBS缓冲液和研磨球，在高通量组织研磨仪（60 Hz）上面进行研磨。
具体的研磨参数参考：生物样本破碎、研磨、匀浆方法与流程 / 微量组织研磨（高通量组织研磨仪）
2、10,000 g离心10 min，将上清转移到新的离心管中，置于冰上保存。
3、打开紫外分光光度计开关预热，将波长调整至至240 nm，利用PBS缓冲液调零，准备试剂（室温放置）。
4、按照下面的体系来配置反应体系
| 试剂 | CK1 | CK2 | 样本组 |
|---|---|---|---|
| 50 mM过氧化氢 | 200 μL | 0 | 200 μL |
| PBS缓冲液 | 800 μL | 800 μL | 600 μL |
| 待测酶液（稀释至合适的倍数） | 0 | 200 μL | 200 μL |
| 加入待测酶液启动反应，迅速放入分光光度计中，记录1 min和2 min的吸光值 |
- 初始吸光值太低怎么办？
- 根据CK1和CK2的吸光值（相加）可以大体推断样本组的初始吸光值，如果初始吸光值过低，而且看到加入酶液中有气泡产生，则说明了酶液的活性太高了，需要将酶液稀释后再进行酶活测定。
- 反应结果不稳定怎么办？
- 反应过程中会产生气泡，气泡会附着在比色皿内壁上面，影响吸光值，所以可以在测定前用手弹一下比色皿，或者在橡胶垫上面震一下比色皿，使得气泡从内壁上脱离之后迅速进行测定。
- 酶本身的吸光值过高怎么办？
- 酶液本身在240 nm处可能也会有吸光值，因此如果酶液（CK2）的初始吸光值太高了就需要稀释酶液，如果稀释酶液后活性降低，则需要延长反应时间。
5、计算CAT的酶活：酶活定义为1 min内催化1 μmol底物（过氧化氢）的酶量为一个单位U
酶活计算公式：U =（ΔA×V×1000）/(Ɛ×Ve×L×t）
U：样本的比酶活，单位为U/mL
ΔA：样品组240 nm处的吸光值差值（0 min吸光值 - 2 min吸光值）
V：反应体系的体积（L），本方案为0.001 L
Ɛ：愈创木酚氧化产物在470nm的摩尔消光系数39.4 M-1cm-1
Ve：酶的体积（mL），本方案为0.2 mL
L：比色皿光程（cm），本方案为1 cm
t：反应时间（min），本方案为2 min
按照本方案：酶液为0.2 mL，反应时间为2 min，简化之后的样本比酶活计算公式为：
U = 63.45×ΔA（U/mL）
注意：
-
酶活过低可以增加反应体系中酶液的体积，也可以增加最初的用来破碎的组织的质量到0.2 g，也可以增加反应时间，但是如果更改了酶液体积或者反应时间之后计算公式就要更改。
-
如果是组织样本按照上面的公式计算没有问题。如果我们的最初的样本是液体培养的菌丝，那么菌丝的含水量对于最终结果会有影响，一定要保证每个样本中的含水量是一致的。
实验记录
| 样本名称和样本信息 | 组织重量和破碎方法 | 1 mL反应体系中加入样本体积（默认0.2 mL） | 稀释倍数（不稀释填写1） | 240 nm吸光值 0 min | 240 nm吸光值 1 min | 240 nm吸光值 2 min | 反应时间（默认10 min） | 原始破碎也中CAT活性（U/mL） |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Sample1：*** | ||||||||
| Sample2：*** | ||||||||
| Sample3：*** |
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