超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（B2/NBT法）

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主笔：于浩、赵书雪

注意事项

超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase， SOD）是一种广泛存在于动植物、微生物中的金属酶，能催化生物体内超氧自由基（O2-）发生歧化反应，生成过氧化氢和氧气。与其他酶（如CAT、POD）等共同构成了生物体的抗氧化酶系统。
SOD的反应是催化超氧自由基生成过氧化氢和氧气，具体反应方程式如下：

2H⁺ + 2O₋^·2 → O2↑ + H₂O₂

测定SOD活性的方法有很多例如nitroblue tetrazolium（NBT）法、adrenaline法、sulfanilamide法等，还有通过检测生成的过氧化氢来检测SOD活性的方法。每一种方法都有其优点和缺点，应该根据自己的实验的实际情况来进行选择。本实验方案采用了NBT法来进行SOD活性的测定。NBT是一种redox-sensitive dye，是一种超氧自由基detector，riboflavin在光照下会产生超氧自由基，使得NBT变色560nm吸光值上升，SOD能够去除超氧自由基从而使得560 nm吸光值下降。
加入每种试剂时都要换取新的枪头，防止污染试剂。清洗比色杯时一定要尽量倒净比色杯里面的蒸馏水。

一、实验准备

1、试剂

PBS缓冲液（用储藏液稀释，具体参考：常见溶液、缓冲液配制方法）

100 mM甲硫氨酸：（14.9 mg/mL）

根据需要配置甲硫氨酸（L-蛋氨酸），称取29.8 mg加入2 mLPBS；称取59.68 mg加入4 mL PBS；称取89.5 mg加入6 mL的PBS缓冲液。

1 mM NBT（氯化硝基四氮唑蓝，CAS : 298-83-9）：（0.818mg/mL）

根据试剂需要称取，如果需要3 mL的NBT，就称取~2.4 mg的NBT，再除以0.818就是加入的PBS的体积（mL）。

比如称取了2.2 mg，则需要加入2.2/0.818=2.69 mL的PBS缓冲液。现用现配，用不完放-20℃，一周内用完。

0.2 mM核黄素：

先配置20 mM的核黄素，称取7.53 mg的riboflavin加入到1 mL的离心管中，加入1 mL的PBS缓冲液，用铝箔包裹后放到-20℃保存，可以放3个月。

根据需要利用20 mM的核黄素稀释100倍，配置成为0.2 mM的核黄素，用于SOD检测。

2、仪器

紫外分光光度计，微量比色杯（狭缝4 mm，1.4 mL比色皿），离心机，组织研磨仪

二、测定SOD酶活

1、将0.1 g的生物样本加入到2 mL的研磨管中，加入1 mL PBS缓冲液和研磨球，在高通量组织研磨仪（60 Hz）上面进行研磨。

具体的研磨参数参考：生物样本破碎、研磨、匀浆方法与流程 / 微量组织研磨（高通量组织研磨仪）

2、10,000 g离心10 min，将上清转移到新的离心管中，置于冰上保存。

3、打开紫外分光光度计开关预热，将波长调整至至560 nm，准备待测试剂（室温放置）。

4、按照下面的体系来配置

试剂	CK-调零	CK-P三个平行	Sample
100 mM甲硫氨酸	100 μL	100 μL	100 μL
0.2 mM核黄素	100 μL	100 μL	100 μL
PBS缓冲液	500 μL	600 μL	500 μL
酶液样本	200 μL	0	200 μL
1 mM NBT	100 μL	100 μL	100 μL
	避光黑暗反应5 min	4000lux，反应5 min	4000lux，反应5 min

反应时间为5 min，5 min后关闭光源，放到一个避光的纸盒中，测定的时候取出用分光光度计来进行560 nm处的吸光值测定。首先测定CK-P三个对照的吸光值，再测定Sample的吸光值，用于酶活的计算。

光照最好用蓝光，但是白光也可以，自己根据实验室条件，利用光度计找一个位置，光照强度为4000 lux，下图是实验室拍照箱作为光源找到的合适的反应位置。

5、计算SOD的酶活：SOD的酶活用超氧自由基的清除率作为酶活

O₋^·2 scavenging activity(%) = [(A_CK-P - A_sample) / A_CK-P] × 100%

O₋^·2 scavenging activity(%)：超氧自由基清除率

A_CK-P ：三个CK-P对照在560 nm处的吸光值的平均值

A_sample：样本在560 nm处的吸光值

再根据加入酶液的体积来换算：“比清除率”，如 **%/mg组织、 **%/mL细胞提取液

2.6、计算公式：酶活定义为以抑制NBT光还原反应50%所需的酶量为一个酶活性单位。

SOD【U\mg=（ACK-AE）VT（0.5ACKWV1）】

SOD总活性以酶单位每g鲜重表示；ACK为空白管吸光度，AE为样品管吸光度，VT为样品液总体积ml，V1为测定时样品用量ml，W为所测样品中蛋白含量mg，

注意：

酶活过低可以增加反应体系中酶液的体积，也可以增加最初的用来破碎的组织的质量到0.2 g。
如果是组织样本按照上面的公式计算没有问题。如果我们的最初的样本是液体培养的菌丝，那么菌丝的含水量对于最终结果会有影响，一定要保证每个样本中的含水量是一致的。

实验记录

样本名称和样本信息	组织重量和破碎方法	1 mL反应体系中加入酶液体积（默认0.2 mL）	稀释倍数（不稀释填写1）
CK-P1	–	–	–
CK-P2	–	–	–
CK-P3	–	–	–
Samp01
Samp02

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