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主笔：于浩、王好、秦语涵
注意事项
1、目前有很多试剂盒可以很好的进行质粒大提，经常需要进行质粒大提建议采用试剂盒法来进行质粒提取，因为试剂盒更加稳定，本方法就是一个技术储备。
2、有一些实验场景需要使用大量的质粒，比如说短期内做大量的分子克隆，需要通过原生质体转化等方式进行质粒的转化，提取低拷贝的质粒，这个时候需要的菌液的体积比较大，传统的柱式质粒小量提取试剂盒无法胜任，但是因为不经常提取，或者从经济角度考虑，这个时候就可以采用醇沉法来进行质粒大提。（如果想要经济节约，酚氯仿异戊醇一定要自己配置）
3、有些时候可能就是想要纯化一下质粒或者线性化的DNA，这个时候可以参考另一个教程“核酸纯化：醇沉法”。
4、本方法仅供参考，不同试剂的体积以及配方可以针对自己的载体特性进行优化、微调。
一、实验准备
1、质粒提取试剂Buffer P1、Buffer P2、Buffer P3（配置方法见本方法第四部分）
2、其他溶液：RNase A、异丙醇（分析纯AR）、70%乙醇（分析纯）、酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）、TE缓冲液、超纯水
70%乙醇配置方法：7.4 mL的95%乙醇 + 2.6 mL的去离子水，建议现配现用
3、50 mL离心管1.5 mL离心管
4、离心机、水浴锅、冰箱
二、实验步骤
1、将带有目标质粒的大肠杆菌菌株接种到LB培养集中，加入适当的抗生素，37℃摇床培养12–16小时（至对数晚期）。
不同的载体培养条件会有差异，有些载体在特定的培养时期数量高，其他的时期都很低，这种情况就需要自己摸索。也有一些载体在所有时期数量几乎一样。
2、取50–100 mL菌液（太多也不好，后面离心取上清的体积会减少），多次离心到50 mL离心管中，4°C，6000×g 离心15分钟，弃上清。
3、重悬：向离心管中加入6 mL的Buffer P1，重悬菌体。（因为质粒大提使用不多，因此RNaseA不用加到P1里面，防止失活）
4、裂解：加入6 mL的Buffer P2，轻轻颠倒混匀，此时大肠杆菌应该破碎，溶液变的粘稠略澄清。时间不要超过5 min，防止质粒变性。
5、中和反应：加入12 mL的Buffer P3，混匀，此时产生白色沉淀，-20 ℃放置10 min，让质粒与沉淀的蛋白、基因组DNA分离，超螺旋质粒保持在上清中。
6、4°C，8000 r/min离心15分钟，将上清转移到新的离心管中，不要吸入沉淀。
不要用螺口的离心管，应该用洗干净的高转速的50 mL离心管，否则后面离心离心管会破碎。
这一步既要小心的转移上清，又要尽可能多的转移上清，菌液越多越难以转移，但是转移的多少会影响最后的回收率，建议取出10-15 mL的上清。
7、 加入等体积的**酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）**混匀，8000 r/min离心15 min，转移上清液至新的离心管。
8、向上清中加入等体积的-20℃预冷的异丙醇，轻轻混匀，-20℃过夜（或者-80 ℃静置30 min）。
9、4°C，8000 r/min 离心20分钟，质粒DNA沉淀在离心管底部，为一层白色物质，丢弃上清。
10、加入3-4 mL的预冷的70%乙醇洗涤DNA沉淀，4°C，8000 r/min 离心10分钟，丢弃上清。
由于上一步是在50 mL的离心管中离心，由于溶液较多，因此沉淀后的核酸会贴在离心管一侧较长的位置。这一步需要用移液枪将核算沉淀冲洗下来到底部的3-4 mL的70%乙醇中。否则核酸一直贴在管壁上，后面无法全部溶解。
11、空气干燥5–10分钟，不要干燥时间太长，白色沉淀消失变为透明说明干燥完成，太干不容易溶解，不完全干燥抑制酶活。
12、最后用100 μL TE缓冲液或超纯水溶解DNA，同时加入1 μL RNase（10 mg/mL），室温溶解30 min，期间要不断的涡旋震荡，最好是50-60℃溶解。也可以在室温溶解12 h以上，同样要经常涡旋振荡。测定质粒浓度和OD260/280比值并跑电泳，记录结果。
一定要跑电泳来最终确定提取的质粒的浓度，因为利用核酸检测仪测定的数据不准确。电泳的时候 2 μL质粒 + 8 μL loading buffer 后上样。最后一步加入RNase A是为了节约成本，也可以直接加到Buffer P1中，如果加到Buffer P1中，Buffer P1需要保存在4℃，尽快使用。
三、可能出现的问题和解决方案
| 问题 | 解决方案 |
|---|---|
| 质粒拷贝数偏低 | 选用高拷贝型质粒、适度增加抗生素浓度，比如使用平时工作浓度2倍的抗生素，保证抗生素不要超期 |
| 在最后一遍利用70%乙醇清洗DNA离心之后，DNA会紧贴着50 mL离心管的外壁一侧，因此在进行TE Buffer溶解的时候要保证外壁上面的DNA全部溶解，如果离心管直立溶解则侧面的DNA没有办法溶解。 （如果洗涤前转移到10~15 mL离心管则稍微好一点） |
|
| 每个不同的质粒都有自己特定的规律，不能所有的质粒套用同一套培养规范，比如说培养时间，培养温度都会影响特定质粒的拷贝数量。培养时间需要恰到好处才行。 | |
| 为了保证稳定性，每次可以从划线的单菌落开始 | |
| 沉淀DNA数量偏少 | 可以增加异丙醇沉淀时间，比如说-20摄氏度沉淀过夜 |
| 质粒难以溶解 | 乙醇残留或过度干燥 |
| 基因组DNA污染 | 加入Buffer P2后裂解时间不要超过5 min，否则基因组DNA会释放出来 加入Buffer P3加入后不要剧烈震荡，避免剪切基因组DNA |
| 底部有拖尾条带 | 没有加入RNase A |
四、缓冲液配置
1、主要试剂（分析纯级别配置即可）
| 试剂 | 成分 | 配方 | 保存条件 |
|---|---|---|---|
| Buffer P1 | 50 mM葡萄糖 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) 10 mM EDTA |
10 mL 0.5 M EDTA (pH 8.0) + 25 mL 1 M Tris-HCl (pH 8.0) + 4.5g葡萄糖 先加400 mL超纯水溶解，后再加超纯水定容至500 mL |
室温（此处无需加入RNase A） |
| Buffer P2 | 200 mM NaOH 1% SDS（w/v） |
20 mL 5 M NaOH + 5 g SDS 先加400 mL超纯水溶解，加超纯水定容至500 mL |
室温（用前检查SDS沉淀） |
| Buffer P3 | 3 M KOAc，pH约5.5 | 120 mL 乙酸钾(5M)，23 mL 乙酸和 57 mL ddH₂O 混合 【乙酸钾(5M)：称取98.14g乙酸钾去离子水溶解，定容至200ml，室温保存】 |
4℃（预冷后使用） |
0.5 M EDTA (pH 8.0)、1 M Tris-HCl (pH 8.0)、5 M NaOH 实验室都有公共试剂，具体配置方法可以参考《常见溶液、缓冲液配制方法》。不需要每次单独配置，3M KOAc的pH调节建议使用pH计，也可以使用pH精密试纸来进行测定。
2、其他试剂
70%乙醇配置方法：7.4 mL的95%乙醇 + 2.6 mL的ddH2O，建议现配现用（不需要考虑混合后体积缩小的问题）
（也可以7 mL无水乙醇 + 3 mL的ddH2O，无水乙醇属危险品，所以建议使用95%乙醇配置）
10 mg/mL的RNaseA溶液：直接购买配置好的溶液，或者自己用TE缓冲液配置。
酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）：
自己购买苯酚、二氯甲烷（代替三氯甲烷）、异戊醇按照比例配置后备用就行，可以长期存放使用。
实验记录
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