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主笔：于浩（参考公司说明书）
一、实验准备
1、改良型BCA蛋白浓度试剂盒（位于公共冰箱4℃）。
试剂盒含有：溶液A、溶液B、溶液D 【还有一个试剂C，放在-20℃冰箱】
2、分装后的标准蛋白，BSA蛋白，浓度为2 mg/mL，每个离心管分装150 μL（正好可以做一次标准曲线）。
3、1.5 mL离心管、涡旋混合仪、金属浴、分光光度计、移液枪、离心管架等。
二、注意事项（必须看）
1、还原剂会影响BCA的测定结果!!! 试剂盒中的特殊试剂C应该是氧化剂能够与巯基反应，可以有效地降低蛋白质抽提样品中残留的还原剂对蛋白质浓度检测的干扰。根据试剂盒中的说明书：当样品中的DTT浓度≤5 mM或β-巯基乙醇浓度≤10 mM时，蛋白质浓度的测定不会受影响。但是建议蛋白浓度在加入DTT之前测定，或者使用Bradford方法进行测定。
2、SDS溶解的蛋白不能用Bradford方法测定浓度，使用BCA测定试剂盒方法进行浓度测定。
3、尿素溶解的蛋白也可以用该方法进行测定，但是Bradford方法更加简单。
4、准确灵敏，线性范围广，BCA试剂的蛋白质测定范围是25~1000 μg/mL（加入测定的25 μL样品的浓度范围）。
5、BCA方法也不能完全准确的测定蛋白浓度，收到的干扰很多。如果要准确确定浓度做好用多种方法，并且要同时做标准曲线。
三、实验步骤（无DTT等还原剂的蛋白）
1、将5×溶液A稀释为1×溶液A， 取溶液A:溶液B按照 50:1 混合， 制成BCA工作液。
配置好的BCA工作液呈现淡蓝色，一定要现用现配（用完倒掉）。
2、向各离心管中加入1 mL的BCA工作液。
3、一般可以按照下面2个比例加入同一个蛋白样品和超纯水，共计25 μL（一定要在记录本上记录好稀释的倍数和加入蛋白的体积，便于后面计算蛋白浓度）调零的空白对照加入25 μL超纯水：
| 样本名称 | 样品体积（μL） | ddH2O（μL） |
|---|---|---|
| 对照 | 0 | 25 |
| 标准品（分装后的2 mg/mL BSA蛋白） | 10 | 15 |
| sample-1 | 5 | 20 |
| sample-2 | 25 | 0 |
4、37℃金属浴中保温30 min。
5、冷却至室温后，利用空白对照进行调零，调零后在分光光度计上测量各管的562nm吸光值。
一定要确保某个体积的测定的吸光值在0.05 ~ 0.6之间，如果吸光值太高需要进一步稀释，如果太低则需要继续增加蛋白的体积。
6、根据浓度计算公式，计算样品浓度。
浓度计算公式
X = 68A562nm — 0.93
A562nm为在562 nm的吸光值
X 为1 mL反应体系里面的蛋白质量（μg）
标准品的吸光值应该在0.3左右，如果相差太大可能需要重新制作标准曲线，或者是自己实验过程中操作出现了问题。
标准曲线计算方法：
如果吸光值是0.25，真实加入的原始样本的体积为10 μL。根据公式计算出来1 mL体系里面蛋白的质量为X=68*0.25-0.93 = 16.05 μg。原始蛋白的浓度C=16.05 / 10 = 1.6 μg/μL。
四、含有DTT等还原剂蛋白的测定步骤
1、将5×溶液A稀释为1×溶液A， 取溶液A：溶液B=50:1， 混匀制成BCA工作液。
配置好的工作液呈现淡蓝色，一定要现用现配（用完倒掉）。
2、向各离心管中加入1 mL的BCA工作液。
3、加入25 μL不同浓度的样品稀释液，迅速涡旋混匀。调零的空白对照加入25 μL超纯水。一般可以按照下面2个比例加入样品蛋白和超纯水（一定要在记录本上记录好稀释的倍数和加入蛋白的体积，便于后面计算蛋白浓度）：
| 样品体积（μL） | ddH2O（μL） |
|---|---|
| 0 （对照） | 25 |
| 5 | 20 |
| 25 | 0 |
4、37℃金属浴中保温30 min。
5、冷却至室温后，利用空白对照进行调零，调零后在分光光度计上测量各管的562nm吸光值。
6、根据标准曲线，计算样品浓度。
四、Check Lists
- 溶解蛋白用的缓冲液 [ ]
- 蛋白中是否加入DTT、巯基乙醇等还原剂，浓度是多少[ ]
| 测试样本名称 | 是否稀释（稀释倍数） | 稀释后加入测试管中的蛋白体积 | 换算后原始样本加入测试管中的蛋白体积 | 562nm吸光值（A562nm） | 跟具公式换算出来的测试管中的蛋白质量（X） | 换算后的原始样本蛋白浓度 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| CK | ||||||
| Sample1 | ||||||
| Sample2 |
五、标准曲线绘制（打开新的一个试剂盒或者标准蛋白吸光值出现较大偏差需要重新制作标准曲线）
1、按照下面的表格来制备不同浓度的BSA蛋白溶液（对于编号1-3，可以先将BSA蛋白稀释10 倍后再加入10、30、50 μL，否则直接加入1 μL体积不准确）
| 溶液\管号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 溶液D或者ddH2O（μL） | 80 | 79 | 77 | 75 | 70 | 60 | 50 | 40 |
| 分装后的2 mg/mL BSA标准溶液（μL） | 0 | 1 | 3 | 5 | 10 | 20 | 30 | 40 |
| BSA浓度（μg/mL） | 0 | 25 | 75 | 125 | 250 | 500 | 750 | 1000 |
2、取16个1.5 mL离心管，每个离心管加入1 mL的BCA工作液。
3、加入编号从0-7的蛋白溶液25 μL到上面的离心管中，每个样品做2个重复。
4、37℃金属浴中保温30 min。
5、冷却至室温后，利用空白对照进行调零，调零后在分光光度计上测量各管的562nm吸光值。（每组用自己的0号管调零）
6、根据结果绘制标准曲线。
六、原理和注意事项
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BCA法是理想的蛋白质定量方法，在碱性环境下蛋白质分子中肽键结构与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA特异地与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nM处有最大的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，颜色的深浅与蛋白质的含量成正比，可以根据吸收值测定蛋白质浓度。该测定方法灵敏度高，操作简单，并且受干扰物质去垢剂（SDS）等影响小。
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传统BCA方法收到还原剂的影响，很多公司改进的试剂盒会带有氧化剂，氧化剂先和蛋白进行反应，将DTT或者巯基乙醇的巯基去除，之后再进行正常的蛋白浓度测定即可。
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