漆酶酶活测定（ABTS法）

主笔：于浩、姚型东、李晓航

注意事项

1、底物ABTS储藏液需要分装后在-20℃保存。缓冲液对于漆酶酶活催化过程会有影响，有些项目需要研究缓冲液对于漆酶酶活的影响，因此配置底物ABTS的时候不要加入缓冲液。

2、虽然说漆酶的抗性较强，但是待测的酶液不要在-20℃保存太长时间，最好及时测定，测定过程中酶要一直放在冰上保持低温状态，其他试剂放在常温下。

3、电源和灯泡需要预热的分光光度计要保证预热时间

4、加入每种试剂时都要换取新的枪头，防止污染试剂。

5、清洗比色杯时一定要尽量倒净比色杯里面的蒸馏水。

6、测定漆酶酶活的底物有很多，比如说染料、丁香醛连氮等，根据自己的实验灵活选择，因为大部分研究都会选择ABTS，因此利用ABTS法结果有可比性。

一、实验准备

1、试剂

ABTS-50缓冲液（-20℃冰箱保存，用前取出）

缓冲液（丙二酸盐缓冲液，pH=4.5，50 mM）或者其他缓冲液（根据不同酶的性质选择缓冲液）（有的方法采用乙酸钠、PBS等，究竟哪个缓冲液更好需要自己摸索）

待测酶液

2、仪器设备

紫外分光光度计，微量比色杯（狭缝4 mm，1.4 mL比色皿）

3、ABTS-50缓冲液配置

准确称量274.3 mg ABTS，加入10 mL的超纯水，混匀后分装至1.5 mL离心管，每个离心管装1 mL（储藏液浓度为50 mM）

二、利用分光光度计测定漆酶酶活

1、打开紫外分光光度计开关预热，将波长调整至至420 nm，利用蒸馏水调零，缓冲液室温保存。

2、提前将ABTS从冰箱中取出，完全融化后涡旋混匀。

可以根据测酶活所需的试剂来配置酶活测定工作液：

0.2 mL的ABTS-50 + 7.8 mL的缓冲液，混匀，配置成为8 mL的酶活测定工作液。

3、向微量比色皿中加入800 μL酶活测定工作液，再加入200 μL待测样品，迅速颠倒混匀。将比色皿放入分光光度计中，记录初始吸光值，并记录30 s和1 min的吸光值。

试剂	体积
酶活测定工作液	800 μL
待测样品	200 μL
	混匀后迅速放入分光光度计，记录420 nm处吸光值

4、计算0 min和1 min的吸光值（OD）差值，使用下面的酶活力计算公式计算酶活力。

根据上面的方法“反应体系为1 mL，标准比色皿的光程为1cm，反应时间为1 min，420 nm处的吸光值差值为ΔOD，定义酶活单位为：1 min内氧化1 μmol的ABTS的酶量为1个酶活单位。则反应体系中酶活单位（E）的计算公式为：

E = ΔOD*0.0278 (U)

根据加入原始样本的体积换算后，可以得到比酶活（U/mL），再根据样本蛋白浓度就可以得到（U/mg蛋白）。

更为完整的酶活力计算公式如下：

D:酶的稀释倍数

Vt:酶活测定总体系的体积（ml）

△OD:1min时间内吸光度变化值

Vs:反应体系的酶液体积（ml）

E:漆酶催化ABTS形成的产物摩尔吸光系数为36000 mol-1·L·cm-1

d:比色杯的直径（cm）

U：酶活（U/L）

注意：

1、如果初始吸光值太高，则说明酶活太高，应该可以目测观察到颜色的变化。这个时候需要将原始样本进行稀释，使得ΔOD不要超过1.5。

2、如果ΔOD值太小（小于0.1），目测也没有颜色的变化。说明了酶的活性太低。可以（1）调整酶活测定体系，增加酶的浓度。例如直接加入20 μL ABTS-50缓冲液、缓冲液和酶液来混合后进行酶活测定，不提前配置工作液。（2）延长反应时间，例如延长至5 min或者10 min。如果反应时间改变了不能套用上面的公式，需要更改公式。

实验记录

样本名称	1 mL反应体系中加入样本体积	稀释倍数	1min内的420nm处ΔOD	比酶活（U/mL）