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主笔:于浩、姚型东、李晓航
注意事项
1、底物ABTS储藏液需要分装后在-20℃保存。缓冲液对于漆酶酶活催化过程会有影响,有些项目需要研究缓冲液对于漆酶酶活的影响,因此配置底物ABTS的时候不要加入缓冲液。
2、虽然说漆酶的抗性较强,但是待测的酶液不要在-20℃保存太长时间,最好及时测定,测定过程中酶要一直放在冰上保持低温状态,其他试剂放在常温下。
3、电源和灯泡需要预热的分光光度计要保证预热时间
4、加入每种试剂时都要换取新的枪头,防止污染试剂。
5、清洗比色杯时一定要尽量倒净比色杯里面的蒸馏水。
6、测定漆酶酶活的底物有很多,比如说染料、丁香醛连氮等,根据自己的实验灵活选择,因为大部分研究都会选择ABTS,因此利用ABTS法结果有可比性。
一、实验准备
1、试剂
ABTS-50缓冲液(-20℃冰箱保存,用前取出)
缓冲液(丙二酸盐缓冲液,pH=4.5,50 mM)或者其他缓冲液(根据不同酶的性质选择缓冲液)(有的方法采用乙酸钠、PBS等,究竟哪个缓冲液更好需要自己摸索)
待测酶液
2、仪器设备
紫外分光光度计,微量比色杯(狭缝4 mm,1.4 mL比色皿)
3、ABTS-50缓冲液配置
准确称量274.3 mg ABTS,加入10 mL的超纯水,混匀后分装至1.5 mL离心管,每个离心管装1 mL(储藏液浓度为50 mM)
二、利用分光光度计测定漆酶酶活
1、打开紫外分光光度计开关预热,将波长调整至至420 nm,利用蒸馏水调零,缓冲液室温保存。
2、提前将ABTS从冰箱中取出,完全融化后涡旋混匀。
可以根据测酶活所需的试剂来配置酶活测定工作液:
0.2 mL的ABTS-50 + 7.8 mL的缓冲液,混匀,配置成为8 mL的酶活测定工作液。
3、向微量比色皿中加入800 μL酶活测定工作液,再加入200 μL待测样品,迅速颠倒混匀。将比色皿放入分光光度计中,记录初始吸光值,并记录30 s和1 min的吸光值。
试剂 | 体积 |
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酶活测定工作液 | 800 μL |
待测样品 | 200 μL |
混匀后迅速放入分光光度计,记录420 nm处吸光值 |
4、计算0 min和1 min的吸光值(OD)差值,使用下面的酶活力计算公式计算酶活力。
根据上面的方法“反应体系为1 mL,标准比色皿的光程为1cm,反应时间为1 min,420 nm处的吸光值差值为ΔOD,定义酶活单位为:1 min内氧化1 μmol的ABTS的酶量为1个酶活单位。则反应体系中酶活单位(E)的计算公式为:
E = ΔOD*0.0278 (U)
根据加入原始样本的体积换算后,可以得到比酶活(U/mL),再根据样本蛋白浓度就可以得到(U/mg蛋白)。
更为完整的酶活力计算公式如下:
D:酶的稀释倍数
Vt:酶活测定总体系的体积(ml)
△OD:1min时间内吸光度变化值
Vs:反应体系的酶液体积(ml)
E:漆酶催化ABTS形成的产物摩尔吸光系数为36000 mol-1·L·cm-1
d:比色杯的直径(cm)
U:酶活(U/L)
注意:
1、如果初始吸光值太高,则说明酶活太高,应该可以目测观察到颜色的变化。这个时候需要将原始样本进行稀释,使得ΔOD不要超过1.5。
2、如果ΔOD值太小(小于0.1),目测也没有颜色的变化。说明了酶的活性太低。可以(1)调整酶活测定体系,增加酶的浓度。例如直接加入20 μL ABTS-50缓冲液、缓冲液和酶液来混合后进行酶活测定,不提前配置工作液。(2)延长反应时间,例如延长至5 min或者10 min。如果反应时间改变了不能套用上面的公式,需要更改公式。
实验记录
样本名称 | 1 mL反应体系中加入样本体积 | 稀释倍数 | 1min内的420nm处ΔOD | 比酶活(U/mL) |
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