原创内容，欢迎转载，转载请注明出处
注意事项
1、本实验方案采用2,6-DMP（2,6-二甲氧基苯酚，91-10-1）作为底物，该方法的特异性不高，虽然2,6-DMP可以用于测定MnP的酶活，但是很多其他的酶（例如漆酶、LPMO、LiP）也可以转化2,6-DMP，如果样本是混合酶液，实际上测定的是多个酶的酶活。测定MnP还可以使用很多其他的底物，例如愈创木酚、O-methoylphenol、ABTS等，这些底物同样可以被其他酶所转化。因此根据实际需要选择底物，并且要注意测定的结果不一定是MnP酶活。
2、底物2,6-DMP储藏液需要分装后在-20℃保存。缓冲液对于MnP酶活有显著影响，有些项目需要研究缓冲液对于MnP酶活的影响，因此配置底物2,6-DMP的时候不要加入缓冲液。
3、虽然说MnP的抗性较强，但是待测的酶液不要在-20℃保存太长时间，最好及时测定，测定过程中酶要一直放在冰上保持低温状态，其他试剂放在常温下。
4、为保证紫外分光光度计测量准确度，电源和灯泡需要预热的分光光度计要保证预热时间。
5、加入每种试剂时都要换取新的枪头，防止污染试剂。
6、清洗比色杯时一定要尽量倒净比色杯里面的蒸馏水。
7、测定MnP酶活可以选择的底物有很多、缓冲液也有很多，究竟应该如何研究MnP的催化性质请参考后续教程。
一、实验准备
1、试剂
2,6-DMP50储藏液（50 mM 2,6-DMP，准确称取77.08 mg 2,6-DMP，加入10 mL的超纯水，混匀后分装至1.5 mL离心管，每个离心管装1 mL）
缓冲液（pH=4.5 的50 mM丙二酸缓冲液、或者其他缓冲液，通常pH在4.5左右）
氯化锰50储藏液（50 mM氯化锰，准确称取98.96 mg四水合氯化锰，加入10 mL的超纯水，混匀后分装至1.5 mL离心管，每个离心管装1 mL）
过氧化氢（浓度在使用用前利用分光光度计在240 nm处进行标定，反应体系中终浓度为0.1 mM）
待测样品
2、仪器
紫外分光光度计，微量比色杯（狭缝4 mm，1.4 mL比色皿）
二、利用分光光度计测定MnP酶活
1、打开紫外分光光度计开关预热，将波长调整至至468 nm，利用蒸馏水调零，选择并配置合适的缓冲液。
2、准备过氧化氢测试液，H2O2是危险品无法随意购买，H2O2本身会分解，因此浓度通常与试剂瓶上面显示的不符，需要先根据摩尔吸光系数（Ɛ240nm = 39.4M-1cm-1）（不同来源资料的Ɛ会有差别，但差异不大，对结果无影响）来进行浓度标定。10 mM的过氧化氢在240 nm处的吸光值应该是0.4，5 mM应该是0.2。5 mM的过氧化氢储藏液用不完可以放到-20℃保存，一个月内不需要重新标定。
危险品使用需要严格遵守"用多少配多少"的原则!
3、配置MnP测定工作液：将0.5 mL的2,6-DMP50储藏液 + 0.5 mL氯化锰50储藏液 + 0.5 mL 5mM的过氧化氢 + 18.5 mL的缓冲液混匀，配置成为20 mL的MnP测定工作液.
4、向微量比色皿中加入800 μL酶活测定工作液，再加入200 μL待测样品，迅速颠倒混匀。将比色皿放入分光光度计中，记录初始吸光值，并记录30 s和1 min的吸光值。
| 试剂 | 体积 |
|---|---|
| MnP测定工作液 | 800 μL |
| 待测样品（稀释到合适的浓度） | 200 μL |
| 混匀后迅速放入分光光度计，记录468 nm处吸光值 2,6-DMP终浓度为1 mM，氯化锰终浓度为1 mM，过氧化氢终浓度为0.1 mM |
5、计算0 min和1 min的吸光值（OD）差值，使用下面的酶活力计算公式计算酶活力。
根据上面的方法“反应体系为1 mL，标准比色皿的光程为1cm，反应时间为1 min，468 nm处的吸光值差值为ΔOD，定义酶活单位为：1 min内氧化1 μmol的2,6-DMP的酶量为1个酶活单位。则反应体系中酶活单位（E）的计算公式为：
EA = ΔOD*0.0144 (U)
根据加入原始样本的体积换算后，可以得到比酶活（U/L），再根据样本蛋白浓度就可以得到（U/mg蛋白）。
更为完整的酶活力计算公式如下：
D:酶的稀释倍数
Vt:酶活测定总体系的体积（ml）
△OD:1min时间内吸光度变化值
Vs:反应体系的酶液体积（ml）
E:锰过氧化物酶催化2,6-DMP形成的产物在468 nm下的摩尔吸光系数为49600 mol-1·L·cm-1
d:比色杯的直径（cm）
U：酶活（U/L）
注意
1、如果初始吸光值太高，则说明酶活太高，应该可以目测观察到颜色的变化。这个时候需要将原始样本进行稀释，使得ΔOD不要超过1.5。
2、如果ΔOD值太小（小于0.1），目测也没有颜色的变化。说明了酶的活性太低。可以（1）调整酶活测定体系，增加酶的浓度。例如直接加入20 μL 2,6-DMP50储藏液 和 氯化锰50储藏液、缓冲液和酶液来混合后进行酶活测定，不提前配置工作液。（2）延长反应时间，例如延长至5 min或者10 min。如果反应时间改变了不能套用上面的公式，需要更改公式。
再次强调：测定的是所有可以氧化2,6-DMP的酶的酶活，并不是特异性的测定MnP的酶活。
实验记录
| 样本名称 | 1 mL反应体系中加入样本体积（默认0.2mL） | 稀释倍数 | 1min内的468nm处ΔOD | 比酶活（U/L） |
|---|---|---|---|---|
| sample1 | ||||
| sample2 | ||||
| sample3 |
评论区