DNS法测定还原糖

原创内容，欢迎转载，转载请注明出处

主笔：姚型东、于浩

注意事项

1、反应在加热过程中务必安装防爆夹，防止水蒸气将离心管上盖冲开，导致样品体积及浓度变化。

2、根据前期探究，按照本方法测量还原糖浓度所得的吸光值应不超过1.2，否则将超出本方法检测的范围。

3、冰水浴效果要比冰浴好，而且温度一致，保证了实验的一致性好。

1、1.5 mL离心管，比色皿（3 mL）；

2、程控五段金属浴（也可用水浴锅代替），紫外分光光度计、微型漩涡混合仪、微型高速离心机。

3、3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液：配置方法见网站试剂配制部分

4、葡萄糖标准溶液：10 mg/mL（现用现配）

1、打开金属浴，设置温度且提升到100℃；打开紫外分光光度计预热，待预热完成后调整波长为540 nm；取适量冰于泡沫盒中，加入适量自来水制作成冰水。

2、在1.5 mL离心管中

实验组：加入0.25 mL待检测样品（如果样本不是特别珍贵，最好测定两个浓度，样本中还原糖不要超过4 mg/mL）和0.25 mL DNS溶液

对照（调零用）：以0.25 mL的水 + 0.25 mL的DNS溶液

阴性对照：以0.25 mL待检测样品的空白组 + 0.25 mLDNS溶液

于微型漩涡混合仪上充分震荡混匀；

3、微型离心机上瞬间离心使反应液全部在离心管下部，安装防爆夹，于100℃金属浴上反应10 min；

4、反应完成后快速取出离心管，不要去掉防爆夹，放到浮子上面，置于冰水浴中轻轻晃动降温，冷却至0℃，冷却期间可轻微颠倒混匀；

5、吸取0.3 mL反应液于比色皿中，加入2.7 mL蒸馏水，充分颠倒混匀。利用对照组调零，测定540 nm下的吸光值并记录。

注意：吸光值不得超过1.2，如果测定的两个浓度其中一个超过了1.2，则需要稀释后再次测定，或者使用吸光值较低的那个样本进行还原糖计算。

6、还原糖浓度计算

建议每次都同时按照下面的方法来做标准曲线，利用标准曲线来计算还原糖浓度。如果发表文章，标准曲线和样本都要做3个重复，以保证数据的可信度。如果只是大体计算一下还原糖浓度，或者说只是为了看看相对的还原糖浓度，对于具体的值要求不高。可以每次配好了DNS试剂之后，做一个标准曲线，每次套公式就行。

下面是用2024年1月配置的DNS试剂做的标曲：

y=2.5904x-0.1882 x是吸光值，y是0.25 mL样品中的葡萄糖浓度。

1、准备5组1.5 mL离心管，每组三个平行，分别编号0，1，2，3，4，5，6，分别按照表1加入5 mg/mL葡萄糖标准溶液，振荡混匀；

表1：不同浓度葡萄糖标准溶液

离心管编号	0	1	2	3	4	5	6
葡萄糖标准液（mL）	0	0.025	0.05	0.075	0.1	0.125	0.15
蒸馏水(mL)	0.25	0.225	0.2	0.175	0.15	0.125	0.1
葡萄糖浓度（mg/mL）	0	0.5	1.0	1.5	2.0	2.5	3.0

2、加入0.25 mL DNS溶液，涡旋混匀后，安装防爆夹，于100℃金属浴反应10 min，反应完成后冰水浴快速冷却至4℃，颠倒混匀；

3、取0.3 mL反应液于比色皿中，加入2.7 mL蒸馏水充分颠倒混匀，以0号组为空白对照，540 nm下测其OD值。

4、以吸光度作为横坐标，葡萄糖浓度（mg/mL）为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线（如图4），得到葡萄糖浓度计算公式为 y=2.5904x-0.1882，相关系数R2=0.9947，标准曲线呈线性相关，符合使用要求。

下面的信息必须要记录到实验本中，按照标准方法DNS的体积和样本体积都是0.25 mL。

上面公式测定的是0.25 mL样本中的还原糖浓度，不是0.5 mL的反应mix中的还原糖浓度，这点需要注意。

样本编号	A	A-CK1	B	B-CK1
样本信息	***	***	***	***
DNS检测液体积（mL）	0.25	0.25	0.25	0.25
待测样本体积（mL）	0.25	0.25	0.25	0.25
样本稀释倍数（没有稀释填写1）	***	***	***	***
OD值	***	***	***	***
稀释前样本中葡萄糖浓度（原始样本中的葡萄糖浓度，需要考虑对照和稀释倍数）	***		***
声明：本次样本测试严格按照网站的最新版实验方案进行操作