纤维素酶活力测定（DNS法）

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主笔：于浩、姚型东

注意事项

纤维素酶是多种酶的混合物，主要包含内切纤维素酶、外切纤维素酶和β葡萄糖苷酶，此外纤维素酶中还含有很多的半纤维素酶。我们通常用生成还原糖的含量来作为标准计算纤维素酶酶活。
纤维素酶测定的底物常用的有羧甲基纤维素钠CMC、滤纸片、微晶纤维素（Avicel）等，利用商品化的纤维素酶做实验，发现利用滤纸片作为底物的时候产生的还原糖含量更多，有可能是其中的半纤维素酶也分解产生了部分还原糖，也有可能是滤纸片中的纤维素更容易被降解。但是滤纸片作为底物的时候本身也会释放还原糖，所以说不建议使用滤纸片作为底物。
利用震荡金属浴和循环水浴锅进行反应可以保证酶与底物充分接触，生成的还原糖从酶的周围扩散出去，尤其是利用滤纸片作为底物的时候。如果没有以上仪器，最好每隔10-15分钟将反应混合液混匀一次。

一、实验准备

1、试剂

50 mM NaAc缓冲液（pH=4.8）：常见溶液、缓冲液配制方法 (mushroomlab.cn)

1%CMC溶液：称取1 g 羧甲基纤维素钠（CMC）溶于100 mL 50 mM乙酸钠缓冲溶液（pH=4.8）中，与50℃水浴锅中温浴搅拌溶解。用不完放到 -20℃保存。

0.5×PBS缓冲溶液：《常见溶液、缓冲液配制方法》

DNS法测定还原糖相关试剂：参考《DNS法测定还原糖》

0.5 M EDTA溶液

2、耗材

透析袋（8KD-14KD）：准备方法参考《常用实验耗材使用方法》

3、仪器设备

循环恒温水浴锅、震荡金属浴、分光光度计

二、纤维素酶酶活测定

透析法去除酶液中的还原糖（根据样本特性选做）

1、很多纤维素酶样本中可能会有大量的还原糖，还原糖会干扰后续的纤维素酶酶活性的判断，因此需要将酶液中的还原糖去除，最方便的做法就是透析法。如果样本中没有还原糖，例如经过亲和层析纯化后的异源表达的重组纤维素酶里面就不会有还原糖那个，这一步就可以不做。

2、透析袋保存在0.5 M EDTA溶液中，将透析袋取出，使用蒸馏水验漏，然后使用蒸馏水清洗3遍，将残留的EDTA清洗干净。

3、根据预优化结果，透析液采用0.5×PBS缓冲溶液，透析液现用现配，用多少配多少。用20×PBS缓冲溶液进行稀释，每100 mL的蒸馏水中加入2.5 mL的20×PBS缓冲溶液。

4、可以按照下面两种方法进行透析

方法1：样本中还原糖含量较低

按照 样本:透析液 = 1:100 (v/v) 进行透析，如果样本总体积为20 mL，则使用2 L的透析液进行透析， 4℃静置透析12 h。

方法2：样本中还原糖含量较高

按照 样本:透析液 = 1:50 (v/v) 进行透析，如果样本总体积为20 mL，则使用1 L的透析液进行透析， 4℃静置透析4-6 h。更换一次透析液，再次透析4-6 h，一共透析12 h。

5、透析后将待检测样本用移液枪转移到离心管中，并计算透析后酶液的体积，用于后续的比酶活测定。

Carboxymethyl Cellulase (CMCase)羧甲基纤维素酶活测定

1、打开循环恒温水浴锅，将温度设置为50℃，打开循环水。

2、按照下面的体系来进行反应

试剂	Control-1	Control-2	实验组
1%CMC溶液	0.3 mL	0	0.3 mL
待测酶液（稀释至合适倍数）	0	0.2 mL	0.2 mL
50 mM NaAc缓冲液	0.2 mL	0.3 mL	0

将Control和实验组的离心管涡旋混合仪上充分震荡混匀，离心管置于浮子上，于50 ℃循环恒温水浴锅中反应120 min。

4、还原糖检测

反应完成后快速取出反应液，加入0.5 mL DNS溶液并涡旋混匀，利用DNS法来检测还原糖的含量，请参考《DNS法测定还原糖 (mushroomlab.cn)》。

测定纤维素酶酶活需要对DNS法进行修改，具体修改部分如下：

1、DNS反应体系为1 mL，而不是0.5 mL。

2、DNS反应之后，取0.6 mL反应液于比色皿中，加入2.4 mL的蒸馏水，充分混匀进行吸光值测定。【注意跟DNS法里面写的一样，调零用蒸馏水代替反应产物】

3、最后的吸光值如果超过了1.0，建议对酶进行稀释后再测定酶活以保证酶活性在线性范围内。

4、葡萄糖计算公式中的吸光值ΔA应该等于样本的吸光值 - Control-1吸光值 - Control-2吸光值，用这个ΔA进行葡萄糖浓度的换算。因为DNS稀释了5倍，因此用DNS方法里面的公式计算后要×2才是最终葡萄糖浓度。

5、酶活计算

酶活性表示方法：可以直接用生成葡萄糖的量作为酶活性来进行表示，比如说 mg glucose·mL酶液^-1·h^-1。也可以用U来表示酶活。

酶活定义：1 min内催化纤维素分解生成1 μmol葡萄糖的酶量定义为一个酶活单位U。

酶活计算示例：

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Filter Paper Cellulase (FPase)滤纸纤维素酶活测定

使用滤纸片作为底物来进行酶活测定的时候，滤纸片本身就会释放还原糖，而且释放的还原糖的量并不低，因此当酶活很低的时候不容易检测到酶活，建议平时就测定CMCase酶活，有需要的时候再补充FPase酶活。

1、制作反应用滤纸片

实验室使用的滤纸为北木的定性滤纸（慢速）（用其他公司的也可以，只要是网上能买到的大厂的滤纸就行，如Whatman No. 1）。

使用打孔器（如下图，最好有储存纸屑的盒子的打孔器）对滤纸片进行打孔，孔的大小~6 mm，每21片的重量约为50 mg。

2、打开金属浴锅，将温度设置为50℃，转速调整至200 rpm。

3、按照下面的体系来进行反应

试剂	Control-1	Control-2	实验组
待测酶液（稀释至合适倍数）	0	0.4 mL	0.4 mL
50 mM NaAc缓冲液	1.0 mL	0.6 mL	0.6 mL
滤纸片（6 mm）	10片	0	10片

将Control和实验组的离心管放入50 ℃震荡金属浴中，200 rpm反应60 min。

3、还原糖检测

反应完成后快速取出反应液，瞬时离心，取出0.5 mL反应液转移到新的1.5 mL的离心管中，加入0.5 mL DNS溶液并涡旋混匀，利用DNS法来检测还原糖的含量，请参考《DNS法测定还原糖 (mushroomlab.cn)》。

测定纤维素酶酶活需要对DNS法进行修改，具体修改部分如下：

1、DNS反应体系为1 mL，而不是0.5 mL。

2、DNS反应之后，取0.6 mL反应液于比色皿中，加入2.4 mL的蒸馏水，充分混匀进行吸光值测定。【注意跟DNS法里面写的一样，调零用蒸馏水代替反应产物】

3、葡萄糖计算公式需要根据稀释倍数来进行校正，在原基础上*2。

4、酶活计算