丙二醛（MDA）含量测定（TBARS-TCA法）

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主笔：于浩、赵书雪

注意事项

TBARS assay (thiobarbituric acid reactive substance assay)常用于检测生物样本如细胞和组织提取液中的膜脂过氧化程度。
本实验方案采用硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid, TBA，504-17-6）作为底物，丙二醛是膜脂过氧化作用的主要产物之一，在高温、酸性条件下，MDA能与硫代巴比妥酸（TBA）发生反应形成红棕色的三甲基复合物（3,5,5-三甲基恶唑-2,4-二酮），该复合物在波长532 nm处有最大光吸收。然而，样品组织中可能对对MDA－TBA反应有干扰作用。因此需要测定532 nm和600 nm处的光吸收。为消除这种干扰，需要计算两个波长处的吸光值差值。

也有文献报道同时测三个吸光值的波长，按照下面公式计算MDA浓度MDA = [6.45(A532-A600)-0.56×A450]×Vt×Vr/(Vs×m)。

加入TCA研磨样品的主要目的是TCA能够沉淀蛋白等杂质，但是对MDA没有影响。不同方法中使用的浓度不同，有5%的还有其他浓度，具体浓度对于结果的影响还需要进一步研究。
在样本破碎的过程中加入Butylated hydroxyl-toluene（BHT）能够组织细胞中脂类进一步过氧化，当然很多实验中这个不是必选操作。有文献说，在反应后加入n-butanol能够将MDA-TBA反应产物沉淀，将n-butanol去除后利用水重新溶解能够增加检测的敏感性。
加入每种试剂时都要换取新的枪头，防止污染试剂。清洗比色杯时一定要尽量倒净比色杯里面的蒸馏水。

1、试剂

0.5% TBA（准确称取0.1 g，加入20 mL的超纯水，根据样品数量配制TBA用多少，配多少，必须现用现配!)

10%TCA（可以用50%的TCA稀释后使用；也可以称取1 g TCA（戴手套），加入10 mL的超纯水，TCA缓冲液稳定，剩余的可以自己保存，下次使用）TCA为危险品，无法随时采购！危险品使用需要严格遵守"用多少配多少"的原则!

2、仪器

紫外分光光度计，微量比色杯（狭缝4 mm，1.4 mL比色皿），金属浴，离心管防爆夹

1、将0.1 g的生物样本加入到2 mL的研磨管中，加入1 mL 10%的TCA溶液和研磨球，在高通量组织研磨仪（60 Hz）上面进行研磨。

2、10,000 g离心10 min，按照下表，将样本不稀释或者稀释到合适的浓度，取0.5 mL样本加入0.5 mL 0.5% TBA，90℃加热30 min。

3、样本放入金属浴后打开紫外分光光度计开关预热，将波长调整至532 nm或600 nm，利用蒸馏水调零。

4、反应完成后将样本冰上冷却至室温，8,000 g离心5 min，取800 μL上清分别在532 nm和600 nm测定吸光值。

离心完成后，先转移上清~800 μL到新的离心管中，防止沉淀重悬。
因为一个样品需要测定两个波长处的吸光值，测完532 nm处的吸光值，用干净的枪头转移样本到新的离心管中，用蒸馏水将比色皿洗干净。一个波长完全测定完毕后，再测定第二个波长。

5、计算MDA含量

MDA（nmol）含量计算公式：

C_MDA=(A532-A600)×6.45 (nmol)

根据组织的重量可以计算出来具体的的MDA含量，例如本方案使用了0.1 mg的组织样本（使用了一半0.5 mL进行MDA含量测定），那么我们最终的MDA的浓度就是：

C_MDA=(A532-A600)*129 (最后的单位是：nmol/mg组织)。

具体计算公式如下：

C_MDA=ΔA×V1000/（E×L×V×M）

ΔA：吸光值差值，A532-A600

V：反应体系的体积（mL），本方案为1 mL

E：摩尔消光系数155 mM^-1cm^-1

L：比色皿的光径（cm），本方案是1 cm

M：组织的重量

注意：

如果是组织样本按照上面的公式计算没有问题。如果我们的最初的样本是液体培养的菌丝，那么菌丝的含水量对于最终结果会有影响，一定要保证每个样本中的含水量是一致的。