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丙二醛(MDA)含量测定(TBARS-TCA法)

食用菌精准育种实验室-实验宝典
2024-01-23 / 0 评论 / 7 点赞 / 8,183 阅读 / 1,459 字

原创内容,欢迎转载,转载请注明出处


主笔:于浩、赵书雪


注意事项

  • TBARS assay (thiobarbituric acid reactive substance assay)常用于检测生物样本如细胞和组织提取液中的膜脂过氧化程度。

  • 本实验方案采用硫代巴比妥酸(2-thiobarbituric acid, TBA,504-17-6)作为底物,丙二醛是膜脂过氧化作用的主要产物之一,在高温、酸性条件下,MDA能与硫代巴比妥酸(TBA)发生反应形成红棕色的三甲基复合物(3,5,5-三甲基恶唑-2,4-二酮),该复合物在波长532 nm处有最大光吸收。然而,样品组织中可能对对MDA-TBA反应有干扰作用。因此需要测定532 nm和600 nm处的光吸收。为消除这种干扰,需要计算两个波长处的吸光值差值。

也有文献报道同时测三个吸光值的波长,按照下面公式计算MDA浓度MDA = [6.45(A532-A600)-0.56×A450]×Vt×Vr/(Vs×m)。

a5.png

  • 加入TCA研磨样品的主要目的是TCA能够沉淀蛋白等杂质,但是对MDA没有影响。不同方法中使用的浓度不同,有5%的还有其他浓度,具体浓度对于结果的影响还需要进一步研究。
  • 在样本破碎的过程中加入Butylated hydroxyl-toluene(BHT)能够组织细胞中脂类进一步过氧化,当然很多实验中这个不是必选操作。有文献说,在反应后加入n-butanol能够将MDA-TBA反应产物沉淀,将n-butanol去除后利用水重新溶解能够增加检测的敏感性。
  • 加入每种试剂时都要换取新的枪头,防止污染试剂。清洗比色杯时一定要尽量倒净比色杯里面的蒸馏水。


一、实验准备

1、试剂

0.5% TBA(准确称取0.1 g,加入20 mL的超纯水,根据样品数量配制TBA用多少,配多少,必须现用现配!)

10%TCA(可以用50%的TCA稀释后使用;也可以称取1 g TCA(戴手套),加入10 mL的超纯水,TCA缓冲液稳定,剩余的可以自己保存,下次使用)TCA为危险品,无法随时采购!危险品使用需要严格遵守"用多少配多少"的原则!

2、仪器

紫外分光光度计,微量比色杯(狭缝4 mm,1.4 mL比色皿),金属浴,离心管防爆夹


二、测定MDA含量

1、将0.1 g的生物样本加入到2 mL的研磨管中,加入1 mL 10%的TCA溶液和研磨球,在高通量组织研磨仪(60 Hz)上面进行研磨。

具体的研磨参数参考:生物样本破碎、研磨、匀浆方法与流程 / 微量组织研磨(高通量组织研磨仪)

2、10,000 g离心10 min,按照下表,将样本不稀释或者稀释到合适的浓度,取0.5 mL样本加入0.5 mL 0.5% TBA,90℃加热30 min。

试剂 体积
待测样品(稀释到合适的浓度) 500 μL
0.5% TBA 500 μL
涡旋混匀后加上防爆夹,迅速放入金属浴中,90℃加热30 min

3、样本放入金属浴后打开紫外分光光度计开关预热,将波长调整至532 nm或600 nm,利用蒸馏水调零。

4、反应完成后将样本冰上冷却至室温,8,000 g离心5 min,取800 μL上清分别在532 nm和600 nm测定吸光值。

  • 离心完成后,先转移上清~800 μL到新的离心管中,防止沉淀重悬。
  • 因为一个样品需要测定两个波长处的吸光值,测完532 nm处的吸光值,用干净的枪头转移样本到新的离心管中,用蒸馏水将比色皿洗干净。一个波长完全测定完毕后,再测定第二个波长。

5、计算MDA含量

MDA(nmol)含量计算公式:

CMDA=(A532-A600)×6.45 (nmol)

根据组织的重量可以计算出来具体的的MDA含量,例如本方案使用了0.1 mg的组织样本(使用了一半0.5 mL进行MDA含量测定),那么我们最终的MDA的浓度就是:

CMDA=(A532-A600)*129 (最后的单位是:nmol/mg组织)

具体计算公式如下:

CMDA=ΔA×V1000/(E×L×V×M)

ΔA:吸光值差值,A532-A600

V:反应体系的体积(mL),本方案为1 mL

E:摩尔消光系数155 mM-1cm-1

L:比色皿的光径(cm),本方案是1 cm

M:组织的重量

注意:

如果是组织样本按照上面的公式计算没有问题。如果我们的最初的样本是液体培养的菌丝,那么菌丝的含水量对于最终结果会有影响,一定要保证每个样本中的含水量是一致的。


实验记录

样本名称和样本信息 组织重量和破碎方法 1 mL反应体系中加入样本体积(默认0.5mL) 稀释倍数(不稀释填写1) 532 nm吸光值 600 nm吸光值 MDA含量
Sample1:***
Sample2:***
Sample3:***
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