过氧化物酶（POD）活性测定（愈创木酚法）

原创内容，欢迎转载，转载请注明出处

主笔：于浩、赵书雪

注意事项

• 过氧化物酶（Peroxidase，POD）是一种氧化还原酶，主要存在于植物和真菌中。它能够催化过氧化物分解，产生氧气和双氧水，同时也能催化一些酚类物质氧化，生成醌类物质。这些物质可以与细胞内的蛋白质、多糖等物质结合，形成褐变产物，影响食品的品质和营养价值。
• 过氧化物酶参与了生物的生长发育、成熟衰老、抗逆、抗氧化等活动，当收到外界刺激、病原菌侵染、逆境、储藏环境变化等作用时，POD酶活会做出应答。是常测的三大抗氧化酶系（CAT、POD、SOD）之一。
• 过氧化物酶能够将愈创木酚（邻甲氧基苯酚，guaiacol）氧化形成4-邻甲氧基苯酚。该产物呈红棕色，在470 nm处有最大光吸收，故可通比色法测定过氧化物酶的活性。但是这个反应的特异性不高，比如说真菌中的漆酶也可以将愈创木酚氧化为红棕色物质，所以说这里面测定的实际上是能够氧化愈创木酚的酶的总酶活。
• 
• 加入每种试剂时都要换取新的枪头，防止污染试剂。清洗比色杯时一定要尽量倒净比色杯里面的蒸馏水。

一、实验准备

1、试剂

PBS缓冲液（用储藏液稀释，具体参考：常见溶液、缓冲液配制方法）

2%愈创木酚（称取0.1 g愈创木酚加入到10 mL离心管中，加入5 mL蒸馏水，配置成为2%的愈创木酚储藏液，现用现配，当天用完!）

2 mM过氧化氢：

H2O2是危险品无法随意购买，H₂O₂本身会分解，因此浓度通常与试剂瓶上面显示的不符，需要先根据摩尔吸光系数（Ɛ240nm = 39.4 M^-1cm^-1）（不同来源资料的Ɛ会有差别，但差异不大，对结果无影响）来进行浓度标定。10 mM的过氧化氢在240 nm处的吸光值应该是0.4，2 mM应该是0.08。标定后，根据需要测定的样品数量，配置2 mM的过氧化氢储藏液。

危险品使用需要严格遵守"用多少配多少"的原则!

2、仪器

紫外分光光度计，微量比色杯（狭缝4 mm，1.4 mL比色皿），离心机

二、测定POD酶活

1、将0.1 g的生物样本加入到2 mL的研磨管中，加入1 mL PBS缓冲液和研磨球，在高通量组织研磨仪（60 Hz）上面进行研磨。

具体的研磨参数参考：生物样本破碎、研磨、匀浆方法与流程 / 微量组织研磨（高通量组织研磨仪）

2、10,000 g离心10 min，将上清转移到新的离心管中，置于冰上保存。

3、打开紫外分光光度计开关预热，将波长调整至至470 nm，利用蒸馏水调零，选择并配置合适的缓冲液（室温放置）。

4、按照下面的体系来进行反应

试剂	对照/体积	样品组/体积
2%愈创木酚	50 μL	50 μL
PBS缓冲液	750 μL	700 μL
待测酶液（稀释至合适的倍数）	200 μL	200 μL
2 mM过氧化氢	0	50 μL
加入过氧化氢后启动反应，开始计时，10 min后用对照组调零，测定样本组在470 nm处的吸光值

5、计算POD的酶活：酶活定义为1 min内催化1 μmol底物（愈创木酚）的酶量为一个单位U

酶活计算公式：U =（ΔA×V×1000）/(Ɛ×Ve×L×t）

U：样本的比酶活，单位为U/mL

ΔA：样品组470 nm处的吸光值

V：反应体系的体积（L），本方案为0.001 L

Ɛ：愈创木酚氧化产物在470nm的摩尔消光系数26.6 mM^-1cm^-1

Ve：酶的体积（mL），本方案为0.2 mL

L：比色皿光程（cm），本方案为1 cm

t：反应时间（min），本方案为10 min

按照本方案：酶液为0.2 mL，反应时间为10 min，简化之后的样本比酶活计算公式为：

U = 0.0075×ΔA（U/mL）

注意：

• 酶活过低可以增加反应体系中酶液的体积，也可以增加最初的用来破碎的组织的质量到0.2 g，但是如果更改了酶液体积之后计算公式就要更改。

• 如果是组织样本按照上面的公式计算没有问题。如果我们的最初的样本是液体培养的菌丝，那么菌丝的含水量对于最终结果会有影响，一定要保证每个样本中的含水量是一致的。

实验记录

样本名称和样本信息	组织重量和破碎方法	1 mL反应体系中加入样本体积（默认0.2 mL）	稀释倍数（不稀释填写1）	470 nm吸光值	反应时间（默认10 min）	POD活性
Sample1：***
Sample2：***
Sample3：***