载体构建：双酶切+T4 DNA连接酶

主笔：于浩，朱丽萍

一、实验准备

1、Pfu酶（用于PCR片段扩增）、Taq酶（用于菌液PCR验证）

2、引物（自己根据扩增片段设计，可以参考：xxxxxxx）

3、模板（根据扩增需求提取扩增菌株的核苷酸序列）

4、超纯水（灭菌分装后使用，用完可以去公共试剂冰箱取用）

5、限制性内切酶（根据实验所需选择相应的酶）

6、离心机、PCR仪、琼脂糖、电泳仪、水浴锅、全温循环水浴锅等

二、注意事项

• 每个步骤都要更换枪头，千万不要造成污染。

• 模板、引物、Mix酶注意低温，一般放在冰上解冻，操作完及时放回冰上。最后完成试验后立即放到-20℃冰箱。

• 提前准备好PCR仪。

• 使用与限制性内切酶合适的buffer。

• PCR以及酶切、连接体系都需要充分均匀：涡旋或震荡之后低速短暂离心（可用掌中宝离心机）。

• 使用buffer前需要全部融化（包括Taq酶的buffer和内切酶的Buffer等）。

• 有些片段带有特殊标记，可以通过这种显色反应或是否生长，来判断是否与载体连接成功。但大多数情况下，目的片段没有任何显性的标记，只能通过最终连接的质粒大小来判断。考虑到载体有一定的自连概率或者载体酶切回收时可能有没有酶切的也会回收到，导致假阳性的出现。这就需要从平板上多挑取一些转化子（6~10个，如果挑了10个都没有，其他的有的可能性也很小），液体培养后，提取质粒，凝胶电泳进行质粒大小鉴定。

三、实验原理

双酶切连接示意图

利用两个黏性末端不同的内切酶对PCR产物DNA片段和载体进行双酶切，各产生两个不同的黏性末端，将酶切后的载体与同样酶切的目的片段通过T4连接酶进行连接。

注意

1、片段通常需要经过PCR获得，在引物设计时需要在上游引物5‘端和下游引物3‘端引入各自相应的酶切位点（并加入保护碱基），最后获得PCR产物即为目标片段。

2、通过采用双酶切，以使两端露出不同的粘性末端，降低自连的概率。如果是单酶切，载体极其容易发生自连，增大筛选难度。

四、实验步骤

1、选择合适的载体、设计引物

根据实验需要选择合适的载体（参考：常见质粒列表）并设计引物（参考：基因异源表达引物设计）。

2、扩增目的条带

目的片段通常需要经过PCR扩增获得1-3k大小不等的目的条带。

（1）PCR扩增目的条带：【必须要使用高保真Pfu酶】

①首先扩增10ul或20 μL小体系，设置退火温度梯度，按照PCR程序进行，结束后进行琼脂糖凝胶电泳，确定一下是否能够扩增出目的条带，也就是大小是否正确。如果不正确可以更改PCR条件，主要是退火温度，或者更换Mix酶继续尝试。

②按照可以获得单一PCR产物的方法继续进行大量扩增（一般60-100 μL）。

（2）PCR产物进行切胶回收

具体步骤见切胶回收（试剂盒法）。

3、准备载体

按照实验要求培养含有目标质粒的菌株，并提取目标质粒，具体步骤见**质粒小提（试剂盒法）**，保证提取的质粒浓度不低于xxx ng/μL。

4、双酶切+切胶回收

（1）将提取的质粒和目的片段分别进行双酶切，具体的酶切体系，参考：“限制性内切酶酶切”。

• 载体（质粒）进行酶切，为了便于充分酶切和后期回收，建议使用大体积（如100ul），进行T4 DNA ligase连接酶连接的载体双酶切尽量切的时间长一点，如果是一步克隆方法连接可以按照标准时间进行双酶切。

（2）将双酶切完成的质粒加入DNA loading buffer进行琼脂糖凝胶电泳（换新的缓冲液），用大宽孔梳子制胶，100v，25-40 min，进行切胶回收，具体步骤见切胶回收（试剂盒法）。

（3）将得到的胶回收产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，查看回收的DNA条带大小是否正确，浓度是否合适，同时用微量分光光度计检测回收片段浓度。

5、T4 DNA ligase连接

利用T4 DNA ligase对回收后的载体和PCR产物进行连接，连接体系见下表，（加样后，可轻微震荡混匀，瞬时离心。）

名称	体积（μL）	反应时间
双酶切质粒	1.5	16℃，30 min【反应在金属浴中进行，如果要过夜连接应该在循环水浴锅中进行过夜连接】
双酶切目的片段	3.5
T4 DNA ligase Mix (Takara，货号6023Q)	5

备注：连接时需要保证片段的量多于载体量，这样片段和载体碰撞概率会高，从而连接成功。严格的话，片段和载体的摩尔比大于3:1，在实际操作中，在保证片段多于载体量的前体下，可以多试几个配比。

6、转化

连接成功的载体，通过转化的方式来筛重组子。

转化的具体方法可以参考：大肠杆菌热激转化方法，一定要选择合适的抗生素，载体对应的抗生素可以查看常见质粒列表。

7、挑单菌落

将长出的单菌落用牙签或者10 μL枪尖挑取到装有800 μL LB培养基的灭菌后的1.5 mL离心管中，注意，LB培养基中要加入正确的抗生素。
将离心管放到离心管架上面，用牛皮纸固定放到37℃震荡培养。【每个平板上可以挑取6-10个单菌落】

8、菌液PCR验证

具体步骤见大肠杆菌菌液PCR方法，利用扩增目的条带用的引物（或者用通用引物例如pET28a可以用T7/T7Ter），利用Taq酶（不要用Pfu）进行PCR扩增，并将PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测。

9、转接

将验证正确的2个阳性转化子接种500 μL到装有50 mL LB培养基的三角瓶中，加入相应的抗生素。

将长好的转化子进行保存菌株600 μL菌液+400 μL 40%GlySalt，在离心管上面做好标注，放到-20摄氏度保存。【参考：临时性细菌、酵母菌株保存】

10、提质粒，送测序

（1）保存菌株后的菌液提取质粒，每个转化子提取1管质粒即可，可以不用无菌操作【测序正确后不想再次培养菌株，这里可以在超净台中倒出~10 mL菌液到洗干净的50 mL离心管中用于质粒提取，其余放在4℃冰箱】。具体方法参考：质粒小提（试剂盒法）。

（2）取出10 μL质粒，装到新的1.5 mL离心管中，送到公司进行测序验证（标注测序引物，如果测序引物是自己合成的需要提供测序引物，参考：测序送样流程）。【不要使用PCR片段扩增引物进行测序，应该使用载体对应的测序引物进行测序，否则片段测不全】

11、保存菌株

将测序正确的转化子重新进行命名和标注，并将菌株重新进行保藏，具体方法参考：细菌菌株保藏方法/细菌、酵母菌株保存（甘油管法）。

实验记录

• 其他实验方法中要求的实验记录内容

• 引物末端是否加酶切位点，两个内切酶分别为____和____

• 酶切位点外部是否加入保护碱基