木聚糖酶活性测定（DNS法）

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主笔：于浩

注意事项

• 木聚糖酶（xylanase，endo -1,4-β-xylanase）是一种能够将木聚糖转化为木糖的酶，木聚糖是半纤维素的主要成分，因此木聚糖酶是半纤维素酶中最重要的组分之一。β-Xylosidases能够从木聚糖的非还原性末端来进行水解生成木糖。除了木聚糖之外还有一些酶能对木聚糖进行分解，例如MnP也能够将木聚糖分解为木糖。

• 就跟纤维素酶酶活测定一样，首先要保证对照的还原糖含量尽量低才能够去更灵敏的测定。因此酶液中如果有还原糖就需要先通过透析来取出里面的还原糖，同样的，要选择木糖比例尽量低的木聚糖作为反应底物，例如Sigma的beechwood xylan（已停产）。来自于阿拉丁的玉米芯木聚糖中还原糖含量非常高，不适合作为底物进行酶活测定。本方案中选用的底物的是来自于源叶的beechwood木聚糖。

一、实验准备

1、试剂

50 mM NaAc缓冲液（pH=4.8）：常见溶液、缓冲液配制方法 (mushroomlab.cn)

1%木聚糖溶液：称取1 g 木聚糖（源叶）溶于100 mL 50 mM乙酸钠缓冲溶液（pH=4.8）中，与50℃水浴锅中温浴搅拌溶解。放到 -20℃保存。

0.5×PBS缓冲溶液：《常见溶液、缓冲液配制方法》

DNS法测定还原糖相关试剂：参考 《DNS法测定还原糖》

0.5 M EDTA溶液

2、耗材

透析袋（8KD-14KD）：准备方法参考 《常用实验耗材使用方法》

3、仪器设备

循环恒温水浴锅、震荡金属浴、分光光度计

二、纤维素酶酶活测定

透析法去除酶液中的还原糖

1、很多纤维素酶/半纤维素样本中可能会有大量的还原糖，还原糖会干扰后续的木聚糖酶活性的判断，因此需要将酶液中的还原糖去除，最方便的做法就是透析法。如果样本中没有还原糖，例如经过亲和层析纯化后的异源表达的重组木聚糖酶就不会有还原糖那个，这一步就可以省略。

2、透析袋保存在0.5 M EDTA溶液中，将透析袋取出，使用蒸馏水验漏，然后使用蒸馏水清洗3遍，将残留的EDTA清洗干净。

3、根据预优化结果，透析液采用0.5×PBS缓冲溶液，透析液现用现配，用多少配多少。用20×PBS缓冲溶液进行稀释，每100 mL的蒸馏水中加入2.5 mL的20×PBS缓冲溶液。

4、可以按照下面两种方法进行透析

方法1：样本中还原糖含量较低

按照 样本:透析液 = 1:100 (v/v) 进行透析，如果样本总体积为20 mL，则使用2 L的透析液进行透析， 4℃静置透析12 h。

方法2：样本中还原糖含量较高

按照 样本:透析液 = 1:50 (v/v) 进行透析，如果样本总体积为20 mL，则使用1 L的透析液进行透析， 4℃静置透析4-6 h。更换一次透析液，再次透析4-6 h，一共透析8-12 h。

5、透析后将待检测样本用移液枪转移到离心管中，并计算透析后酶液的体积，用于后续的比酶活测定。

木聚糖酶活测定

1、打开循环恒温水浴锅，将温度设置为50℃，打开循环水。

2、按照下面的体系来进行反应

试剂	Control-1	Control-2	实验组
1%木聚糖溶液	0.2 mL	0	0.2 mL
待测酶液（稀释至合适倍数）	0	0.1 mL	0.1 mL
50 mM NaAc缓冲液	0.3 mL	0.4 mL	0.2 mL

将Control和实验组的离心管涡旋混合仪上充分震荡混匀，离心管置于浮子上，于50 ℃循环恒温水浴锅中反应30 min。
反应完成后迅速向小离心管中加入0.5 mL的DNS试剂终止反应。

还原糖（木糖）含量测定和酶活计算

具体操作步骤请参考：《DNS法测定还原糖》

1、打开金属浴，设置温度且提升到100℃；打开紫外分光光度计预热，待预热完成后调整波长为540 nm；取适量冰于泡沫盒中，加入适量自来水制作成冰水。

2、在1.5 mL离心管中按照下面的表格配置体系

试剂	调零组	Control-1	Control-2	实验组
DNS溶液	0.5 mL	0.5 mL	0.5 mL	0.5 mL
样品	0	0.5 mL Control-1反应液	0.5 mL Control-2反应液	0.5 mL 实验组反应液
50 mM NaAc缓冲液	0.5 mL	0	0	0

以上反应液于微型漩涡混合仪上充分震荡混匀，微型离心机上瞬间离心使反应液全部在离心管下部，安装防爆夹，于100℃金属浴上反应10 min。

3、反应完成后快速取出离心管，不要去掉防爆夹，放到浮子上面，置于冰水浴中轻轻晃动降温，冷却至0℃，冷却期间可轻微颠倒混匀；

4、吸取0.6 mL反应液于比色皿中，加入2.4 mL蒸馏水，充分颠倒混匀。利用对照组调零，测定540 nm下的吸光值并记录。

注意：吸光值不得超过1.2，如果超过1.2则需要将酶液稀释之后重新进行酶活测定。

5、还原糖浓度计算

建议每次都用木糖绘制标准曲线，木糖的浓度范围如下（0 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.2 mg/mL、1.6 mg/mL、2.0 mg/mL）。

下面是用2024年1月配置的DNS试剂做的木糖的标曲：

y= 0.775x - 0.0169

x是吸光值，y是反应液中的木糖浓度（记为C_G，单位是mg/mL）。

6、酶活性计算

酶活定义：1 min内催化木聚糖分解生成1 μmol木糖的酶量定义为一个酶活单位U。

酶活计算示例：

E = (C_G×V×1000) / (150.13×t×V_E)

E：酶活（单位U/mL）

C_G：上一步得到的反应液中的木糖浓度，单位是mg/mL （g/L）

V：木聚糖酶酶活测定反应体系的体积（单位是mL），本方案为0.5 mL

1000：换算成μmol的系数

150.13：木糖的分子量

t：反应时间（单位分钟），本方案是30 min

V_E：测酶活时加入酶液的体积（单位mL）本方案是0.1 mL

按照上面的公式，根据本方案的体系（0.5 mL反应体系，0.1 mL酶液<假设不稀释>，反应30 min）简化之后的公式如下：

E = 1.11×C_G (U/mL)

实验记录

样本名称和样本信息	组织重量和破碎方法	反应体系和加入酶液体积	稀释倍数（不稀释填写1）	DNS吸光值	酶活
Control-1
Control-2
Sample01
Sample01