主笔：于浩、李晓航
一、实验准备
1、待纯化蛋白样品
2、缓冲液（一般是Tris-HCl或者磷酸盐缓冲液，pH在7.5左右）
3、1 M 咪唑溶液
4、50 mL离心管
5、超滤管（根据目的蛋白的大小选择，一般用10 KDa大小的）
6、His-Tag重力柱，参考：His-Tag重力柱制备和Ni-NTA介质再生
7、20%乙醇
8、冷冻离心机
二、注意事项
- 全程都要在4℃下进行，防止蛋白失活。
- 应密切监控柱子的载量，防止过载而造成样品浪费。
- 如果层析柱结合效率过低，可以考虑对介质进行再生，具体方法参考：His-Tag重力柱制备和Ni-NTA介质再生
三、实验流程
如果柱效降低，或者做过一段时间没有再生，则需要再生，参考：His-Tag重力柱制备和Ni-NTA介质再生
1、冲洗柱子（此步骤按照柱体积2 mL计算）
放在冰箱里面保存的重力柱里浸泡在20%乙醇中，我们首先要把柱子里面的乙醇更换成蛋白破碎时使用的缓冲液，所以首先打开重力柱上下的盖子，使乙醇自然流出，表面看不到残留的乙醇。
加入10 mL的缓冲液，使缓冲液自然流出，完全流出；
再次加入10 mL缓冲液，使缓冲液自然流出，完全流出。
2、蛋白上样
这个步骤的主要目的就是使得含有His标签的蛋白与Ni-NTA介质结合。将离心后上清液缓慢加入到重力柱中，使得蛋白样品自然流出，不含有His标签的蛋白不能与亲和介质结合，因此从下面流出；
3、冲洗
这一步的目的是将不能结合的蛋白进一步的清洗干净，使得我们获得的蛋白更加纯净。
加入10 mL的缓冲液，自然流出（直至完全流出）；
再次加入10 mL的缓冲液，自然流出（直至完全流出）；
【如果后面纯化的蛋白仍然后很多杂带，这一步可以增加一步用含有低浓度咪唑（例如5 mM咪唑）的缓冲液10 mL进行冲洗，把结合力弱的杂蛋白冲洗掉。】
4、洗脱
利用含有高浓度咪唑的缓冲液进行蛋白洗脱，咪唑与组氨酸的结构类似，因此可以与组氨酸竞争与Ni结合，咪唑浓度高了蛋白就会从Ni柱上面脱离下来，最终我们就可以获得我们需要的蛋白。
蛋白种类不同，所需要洗脱的浓度也不同，一般我们会用预实验对目标蛋白的洗脱浓度进行定量，一般洗脱浓度梯度在10-200 mM咪唑就可以将我们的目标蛋白洗脱下来，每个梯度加入5 mL的含有40 mM咪唑的缓冲液，把流出液用小离心管接出来。
注：我们的蛋白就在洗脱流出液里面！！！所以用新的管子接
5、冲洗重力柱
首先用含有200 mM咪唑的缓冲液20 ml冲洗凝胶介质，使得没有脱落的蛋白全部脱落；
再加入10 mL的蒸馏水，冲洗层析柱，重复一次；
最后加入20%乙醇，将层析柱放下4摄氏度保存。
6、蛋白超滤，去除咪唑
利用超滤管进行蛋白超滤，超滤的目的是去除高浓度的咪唑，因为高浓度咪唑会影响酶活，具体步骤如下：将洗脱流出液加入到超滤管中，高速低温离心，将蛋白浓缩到少于0.5 mL；
丢弃滤出液，在顶部加入10 mL的缓冲液，再次进行超滤浓缩。
反复3-4次，把咪唑浓度降低【稀释倍数至少1000倍以上】。
Check Lists
- 纯化的蛋白为____
- 使用的缓冲液是____
- 蛋白上样完成后是否用缓冲液冲洗色谱柱
- 是否用低浓度咪唑冲洗色谱柱，如果有，咪唑浓度为____mM
- 完成蛋白纯化后是否用200 mM咪唑洗脱重力柱
- 是否用蒸馏水冲洗重力柱2次
- 是否将重力柱中的缓冲液更换成20%乙醇
- 蛋白是否进行超滤，超滤次数为____次
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