侧边栏壁纸
  • 累计撰写 51 篇文章
  • 累计创建 1 个标签
  • 累计收到 14 条评论
标签搜索

目 录CONTENT

文章目录

蛋白纯化:Ni-NTA重力柱亲和层析纯化带有His标签的蛋白

食用菌精准育种实验室-实验宝典
2023-09-14 / 0 评论 / 1 点赞 / 1,789 阅读 / 1,238 字

主笔:于浩、李晓航


一、实验准备

1、待纯化蛋白样品
2、缓冲液(一般是Tris-HCl或者磷酸盐缓冲液,pH在7.5左右)
3、1 M 咪唑溶液
4、50 mL离心管
5、超滤管(根据目的蛋白的大小选择,一般用10 KDa大小的)
6、His-Tag重力柱,参考:His-Tag重力柱制备和Ni-NTA介质再生
7、20%乙醇
8、冷冻离心机


二、注意事项

  • 全程都要在4℃下进行,防止蛋白失活。
  • 应密切监控柱子的载量,防止过载而造成样品浪费。
  • 如果层析柱结合效率过低,可以考虑对介质进行再生,具体方法参考:His-Tag重力柱制备和Ni-NTA介质再生

三、实验流程

如果柱效降低,或者做过一段时间没有再生,则需要再生,参考:His-Tag重力柱制备和Ni-NTA介质再生

1、冲洗柱子(此步骤按照柱体积2 mL计算)
放在冰箱里面保存的重力柱里浸泡在20%乙醇中,我们首先要把柱子里面的乙醇更换成蛋白破碎时使用的缓冲液,所以首先打开重力柱上下的盖子,使乙醇自然流出,表面看不到残留的乙醇。

加入10 mL的缓冲液,使缓冲液自然流出,完全流出;

再次加入10 mL缓冲液,使缓冲液自然流出,完全流出。

2、蛋白上样
这个步骤的主要目的就是使得含有His标签的蛋白与Ni-NTA介质结合。将离心后上清液缓慢加入到重力柱中,使得蛋白样品自然流出,不含有His标签的蛋白不能与亲和介质结合,因此从下面流出;

3、冲洗
这一步的目的是将不能结合的蛋白进一步的清洗干净,使得我们获得的蛋白更加纯净。

加入10 mL的缓冲液,自然流出(直至完全流出);

再次加入10 mL的缓冲液,自然流出(直至完全流出);

【如果后面纯化的蛋白仍然后很多杂带,这一步可以增加一步用含有低浓度咪唑(例如5 mM咪唑)的缓冲液10 mL进行冲洗,把结合力弱的杂蛋白冲洗掉。】

4、洗脱
利用含有高浓度咪唑的缓冲液进行蛋白洗脱,咪唑与组氨酸的结构类似,因此可以与组氨酸竞争与Ni结合,咪唑浓度高了蛋白就会从Ni柱上面脱离下来,最终我们就可以获得我们需要的蛋白。

蛋白种类不同,所需要洗脱的浓度也不同,一般我们会用预实验对目标蛋白的洗脱浓度进行定量,一般洗脱浓度梯度在10-200 mM咪唑就可以将我们的目标蛋白洗脱下来,每个梯度加入5 mL的含有40 mM咪唑的缓冲液,把流出液用小离心管接出来。

注:我们的蛋白就在洗脱流出液里面!!!所以用新的管子接

5、冲洗重力柱
首先用含有200 mM咪唑的缓冲液20 ml冲洗凝胶介质,使得没有脱落的蛋白全部脱落;

再加入10 mL的蒸馏水,冲洗层析柱,重复一次;

最后加入20%乙醇,将层析柱放下4摄氏度保存。

6、蛋白超滤,去除咪唑
利用超滤管进行蛋白超滤,超滤的目的是去除高浓度的咪唑,因为高浓度咪唑会影响酶活,具体步骤如下:将洗脱流出液加入到超滤管中,高速低温离心,将蛋白浓缩到少于0.5 mL;

丢弃滤出液,在顶部加入10 mL的缓冲液,再次进行超滤浓缩。

反复3-4次,把咪唑浓度降低【稀释倍数至少1000倍以上】。


Check Lists

  • 纯化的蛋白为____
  • 使用的缓冲液是____
  • 蛋白上样完成后是否用缓冲液冲洗色谱柱
  • 是否用低浓度咪唑冲洗色谱柱,如果有,咪唑浓度为____mM
  • 完成蛋白纯化后是否用200 mM咪唑洗脱重力柱
  • 是否用蒸馏水冲洗重力柱2次
  • 是否将重力柱中的缓冲液更换成20%乙醇
  • 蛋白是否进行超滤,超滤次数为____次
1

评论区