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His-Tag重力柱制备和Ni-NTA介质再生

食用菌精准育种实验室-实验宝典
2023-09-13 / 0 评论 / 0 点赞 / 453 阅读 / 544 字

主笔:于浩、李晓航

His-Tag重力柱制作(首次使用)

一、实验准备(柱体积2 mL)

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二、实验步骤

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His-Tag纯化介质再生步骤

一、实验准备(以柱体积2 mL计算)

1、5 mL 6 M Urea6 M GdmCl

2、20 mL超纯水

3、5 mL 100 mM EDTA, pH 8.0(现用现配,用多少配多少,利用0.5 M EDTA缓冲液(pH 8.0)进行稀释)

4、5 mL 0.5 M的NaOH(现用现配,可以用5 M NaOH溶液进行稀释)

5、5 mL的0.1 M硫酸镍

6、20 ml 20%乙醇(现用现配,用多少配多少,直接用无水乙醇或者95%的乙醇进行配置,配置可以将95%乙醇等同于无水乙醇)

二、注意事项

  • 使用过一段时间的凝胶介质结合蛋白的能力会变差,杂质变多,这个时候就需要对凝胶介质进行再生。所有再生步骤使用的试剂都需要过滤。

  • 注意盐酸胍很脏,事先一定要用0.22微米滤膜过滤,除掉杂质。

  • 硫酸镍浸泡时间4-6h效果最佳。

三、实验步骤

1、首先加入5 mL的6 M Urea6 M GdmCl,浸泡5 min,5 min后使6 M Urea6 M GdmCl完全流出;

2、用5 mL超纯水洗两遍,每次都要使得超纯水完全流出;

3、加入5 mL的100 mM EDTA, pH 8.0,方法同上;

4、加入5 mL 0.5 M的NaOH,清洗,方法同上;

5、用5 mL超纯水洗两遍,方法同上;

6、加入5 mL的0.1 M硫酸镍,浸泡2 h以上,使硫酸镍流出;

7、用5 mL超纯水洗3遍,方法同上;

8、将超纯水更换成为20%乙醇,使得20%乙醇液面高于Ni-NTA介质 1 cm以上,放在4℃长期保存。

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