主笔：于浩、李晓航

His-Tag重力柱制作（首次使用）

一、实验准备（柱体积2 mL）

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二、实验步骤

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His-Tag纯化介质再生步骤

一、实验准备（以柱体积2 mL计算）

1、5 mL 6 M Urea或 6 M GdmCl

2、20 mL超纯水

3、5 mL 100 mM EDTA, pH 8.0（现用现配，用多少配多少，利用0.5 M EDTA缓冲液（pH 8.0）进行稀释）

4、5 mL 0.5 M的NaOH（现用现配，可以用5 M NaOH溶液进行稀释）

5、5 mL的0.1 M硫酸镍

6、20 ml 20%乙醇（现用现配，用多少配多少，直接用无水乙醇或者95%的乙醇进行配置，配置可以将95%乙醇等同于无水乙醇）

二、注意事项

• 使用过一段时间的凝胶介质结合蛋白的能力会变差，杂质变多，这个时候就需要对凝胶介质进行再生。所有再生步骤使用的试剂都需要过滤。

• 注意盐酸胍很脏，事先一定要用0.22微米滤膜过滤，除掉杂质。

• 硫酸镍浸泡时间4-6h效果最佳。

三、实验步骤

1、首先加入5 mL的6 M Urea或 6 M GdmCl，浸泡5 min，5 min后使6 M Urea或 6 M GdmCl完全流出；

2、用5 mL超纯水洗两遍，每次都要使得超纯水完全流出；

3、加入5 mL的100 mM EDTA, pH 8.0，方法同上；

4、加入5 mL 0.5 M的NaOH，清洗，方法同上；

5、用5 mL超纯水洗两遍，方法同上；

6、加入5 mL的0.1 M硫酸镍，浸泡2 h以上，使硫酸镍流出；

7、用5 mL超纯水洗3遍，方法同上；

8、将超纯水更换成为20%乙醇，使得20%乙醇液面高于Ni-NTA介质 1 cm以上，放在4℃长期保存。