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主笔：苏瑶、于浩
一、实验准备
1、改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒（位于公共冰箱4℃）。
2、1.5 ml离心管、涡旋仪、分光光度计等。
二、注意事项
1、推荐使用该方法进行蛋白浓度测定，操作简便迅速，消耗样品数量少。
2、此方法不能用于SDS溶解的蛋白的浓度测定，此方法容易收到强碱性缓冲液、TritonX-100、去垢剂等影响，不同蛋白测定会有偏差。
3、标准曲线一定要参考本实验方法，没有必要每次绘制标准曲线，在每次开启一瓶新的BradFord的试剂的时候绘制一次标准曲线就可以了，每次重新绘制标准曲线之后要修改本方法中的公式，并且标记好吸光值准确的浓度范围。
4、需要注意的是，不同的Bradford测出来的这个标曲的蛋白浓度和线性范围都不同，所以测定的时候最好不要超过0.6，而且要测定两个浓度，这两个浓度的吸光值最好都落在0.3-0.6之间，而且浓度与吸光值呈现线性关系才是准确的。否则测定的值没有意义。
5、试剂盒使用完毕后一定要放回4℃冰箱。
三、实验步骤
1、准备1.5 mL离心管，490 μL超纯水 ，再加入0.5 mL Bradford测定试剂,涡旋混匀，配制成为Bradford工作液。
最终体积可能不是准确的1 mL，为了操作简单，这部分偏差可以忽略，所以在一开始统一加入490 μL超纯水。
2、向其中一个离心管中加入10 μL超纯水，此管作为阴性对照，用于分光光度计调零。
3、每个蛋白至少测定2个浓度，根据自己蛋白的浓度，向离心管中加入5 μL~20 μL体积的蛋白样品（选择2个体积，如果后面测定的吸光值不在线性范围就重新修改蛋白体积，或者稀释，或者增加体积）。
如果浓度比较高（大于1 mg/mL）则可以加入5 μL和10 μL。
如果浓度比较低（小于1 mg/mL）则可以加入10 μL和20 μL尝试。
4、加入蛋白样品后迅速涡旋混匀。
5、室温（25-30℃）静置10 min后利用微量分光光度计测定OD595 nm吸光值（应该在30 min内完成测定），测定吸光值的时候应该从颜色比较浅的开始测定，中间不需要用蒸馏水冲洗比色皿。
如果吸光值在0.3~0.6之间，而且两个不同浓度计算出来的蛋白浓度大体呈现线性，则测定浓度的结果可以使用
如果吸光值不在范围内，或者两个不同浓度的蛋白浓度与真实浓度相差很大，则需要重新调整浓度到恰当的浓度范围内（根据吸光值调整），再次进行蛋白浓度测定
6、根据标准曲线，计算样品浓度。
标准曲线(科技楼2023-11更新)
X = (A595nm - 0.0714)/0.0478
A595nm：待测蛋白在595 nm的吸光值，吸光值应该在0.2 ~ 0.6之间（线性范围）
X：反应体系里面的蛋白质量（μg）
（反应总体积为1 mL）
如果加入的蛋白样品为3 μL，595 nm的吸光值为0.50，根据公式X值为 (0.5-0.0714)/0.0478 = 8.97 (μg)。
则蛋白浓度为 8.97 μg / 3 μL = 2.99 μg/μL。
四、Check Lists
- 是否存在SDS、去垢剂、TritonX-100等干扰物____
- 是否以超纯水为阴性对照进行分光光度计调零____
- 是否提前打开分光光度计____
- 是否测定两个浓度____
- 加入样品的初始体积为____，吸光值为____，根据公式计算的浓度为____
五、标准曲线绘制（每次启用一瓶新的Bradford试剂的时候需要测定标准曲线）
取出试剂盒里面的BSA标准蛋白1 μg/μL，完全融化后，充分涡旋振荡使蛋白混匀，静置1 mL。
取一新的1.5 mL离心管，加入400 μL的超纯水。
准确吸取100 μL（用同一把移液枪吸取）加入到离心管中，充分涡旋振荡，稀释成为0.2 μg/μL标准蛋白。
| 溶液/管号 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 超纯水（μL） | 500 | 498 | 492 | 488 | 484 | 480 | 470 | 450 |
| 0.1 μg/μL标准蛋白（μL） 全部用10 μL移液枪准确吸取 |
0 | 2 | 8 | 12 | 16 | 20 | 30 | 50 |
| Bradford试剂（μL） | 500 | 500 | 500 | 500 | 500 | 500 | 500 | 500 |
| 反应体系中的蛋白质量（μg） | 0 | 0.4 | 1.6 | 2.4 | 3.2 | 4.0 | 6.0 | 10.0 |
加入蛋白样品后迅速涡旋混匀。室温（25-30℃）静置10 min后利用微量分光光度计测定OD595 nm吸光值（应该在30 min内完成测定），测定吸光值的时候应该从颜色比较浅的开始测定，中间不需要用蒸馏水冲洗比色皿。
根据吸光值和反应体系中的蛋白质量（μg）来绘制散点图，并进行曲线拟合，最终得到标准曲线。
把标准曲线更新到本方法中
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