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注意事项
1、配胶的时候需要佩戴手套，染色和脱色在通风橱中进行。
2、完成试验后将配胶所用试剂放到4℃冰箱。
3、做好的胶可包裹吸水纸放入4℃冰箱保存~2周。
4、玻璃板一定要洗干净，先用洗洁精清洗，再用自来水冲洗，最后用蒸馏水或超纯水冲洗后沥干。
5、温度对于PAGE胶的凝胶时间有很大的影响，因此环境温度越高凝胶速度越快，交联剂（APS和TEMED）浓度越高凝胶速度越快，因此在冬季低温下配胶常常会出现凝胶时间过长的现象，这个时候如果试剂本身没有问题可以转移到温暖的环境（20℃以上）加大交联剂浓度后配胶。
一、实验准备
1、试剂
丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺 30%溶液、超纯水、Temed；
4×分离胶buffer pH 8.8、4×浓缩胶buffer pH6.8、10%（w/v）SDS、10%（w/v）APS、5×Loading buffer、10×电泳缓冲液、染色液、脱色液（具体配方参考：常见溶液、缓冲液配制方法）。
2、仪器
SDS-PAGE电泳仪、脱色摇床等。
二、利用分光光度计测定MDA含量
1、配胶
因为SDS-PAGE胶可以在4摄氏度放2周以上，因此每次配置4块PAGE胶，按照下面的配方来进行配置。
两个胶板之间的厚度常用的有两种规格分别是0.75 mm/1.0 mm，目前实验室大部分为1.0 mm的厚板（0.75 mm的应该更为常见）。
要按照下面的顺序来加入试剂，最后加入TEMED，加入SDS之后不要剧烈搅拌，否则会产生大量气泡，应该轻轻的搅拌。加入TEMED之后迅速搅拌均匀后加入胶板中。
凝胶的时间一般在20-30min，凝胶时间可以通过控制APS和TEMED的浓度来控制，一般冬天需要增加APS和TEMED浓度，夏天需要降低APS和TEMED浓度（否则会凝聚过快）。
（1）首先配置分离胶
| 胶厚度 | 0.75 mm | 1.0 mm |
|---|---|---|
| 胶浓度 | 12.5% | 12.5% |
| 30%聚丙烯酰胺 | 6.67 mL | 8.89 mL |
| 三蒸水 | 5.33 mL | 7.10 mL |
| 4×分离胶buffer pH 8.8 | 4 mL | 5.33 mL |
| 10%（w/v）SDS | 160 μL | 213 μL |
| 10%（w/v）APS | 80 μL（冬季可以加入120 μL） | 107 μL（冬季可以加入160 μL） |
| Temed | 16 μL（冬季可以加入24 μL） | 21 μL（冬季可以加入32 μL） |
（2）再配置浓缩胶。
浓缩胶0.75 mm/1.0 mm四块胶配方
| 胶厚度 | 0.75 mm | 1.0 mm |
|---|---|---|
| 胶浓度 | 3.25% | 3.25% |
| 30%聚丙烯酰胺 | 0.86 mL | 1.15 mL |
| 三蒸水 | 5.14 mL | 6.85 mL |
| 12×浓缩胶buffer pH6.8 | 2.0 mL | 2.7 mL |
| 10%（w/v）SDS | 80 μL | 107 μL |
| 10%（w/v）APS | 40 μL（冬季可以加入60 μL） | 53 μL（冬季可以加入80 μL） |
| Temed | 8 μL（冬季可以加入12 μL） | 10 μL（冬季可以加入15 μL） |
2、样品处理
（1）E. coli全细胞样本处理
取部分E. coli细胞，10000 rpm离心2 min，将上清去除。加入20 μL 10xProtein loading Buffer，安装防爆夹之后，煮沸5 min，煮沸后涡旋混匀1min，10000 rpm离心2 min，上清即为全细胞蛋白样品。
（2）蛋白样品处理
如果样品是蛋白，可以直接向蛋白中加入 10xProtein loading Buffer，混合均匀后直接上样，无需煮沸处理。
通常不加入DTT不会影响SDS-PAGE电泳效果，是否加入DTT可以自己根据实际需要选择。
3、上样电泳
（1）将10×电泳缓冲液稀释至1×，倒入两块胶板中间使其溢出并没过胶板底部，拔掉梳子。
（2）将样品和Loading buffer混匀后加入到上样孔中（一般上样量控制在10-15 μL），0.75 mm的胶板每孔最多上样20 μL，1.0 mm的胶板每孔最多上样25 μL**。**
如果样本比较少，点在胶的中间区域。
（3）电泳：100~120 V恒压指示剂进入浓缩胶；改换120~160 V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳。
如果检测的目标蛋白分子量较低，则等指示剂距离底部还有1-2 cm的时候停止电泳。
4、染色、脱色和拍照
（1）染色和脱色：取出胶板于0.25％考马斯亮蓝染色液中染色约30 min，倾出染色液（染色液可以重复使用几次，第一次使用的染色液倒到一个标记“用过”的棕色瓶中），用蒸馏水冲洗PAGE胶。
（2）向脱色盒中加入脱色液，放在水平摇床上缓慢摇动，注意更换染色液，直至条带清晰可见。
染色前用微波炉加热可以加快染色和脱色进度，但是不利于染色液循环使用，而且房间内会有乙酸的味道。
（3）一般情况下脱色后将PAGE胶放到带有背光的拍照仪上，用手机拍照。
实验记录
附电泳图
| 样本名称 | Marker | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 样本信息 | ||||||||||
| 蛋白浓度/细菌OD值 | ||||||||||
| Marker信息（Marker端切角） |
SDS-PAGE原理
蛋白中含有很多的氨基(+)和羧基(-)，不同的蛋白在不同的pH值下表现出不同的电荷，为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，我们在上样前，通常会进行一些处理(上样
缓冲液)。即在样品中加入含有SDS 和β-巯基乙醇的上缓冲液。SDS 即十二烷基磺酸钠
（CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+），是一种阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构；β-巯基乙醇是强还原剂，它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键。电泳样品加入样品处理液后，经过高温处理，其目的是将SDS 与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构同时使整个蛋白带上负电荷；另外样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于监控整个电泳过程；另外样品处理液中还加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以快速沉入样品凹槽底部。当样品上样并接通两极间电流后(电泳槽的上方为负极，下方为正极)，在凝胶中形成移动界面并带动凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物向正极推进。样品首先通过高度多孔性的浓缩胶，使样品中所含SDS 多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。
电泳启动时，蛋白样品处于pH6.8 的上层，pH8.8 的分离胶层在下层，上槽为负极，下槽为正极。出现了 pH 不连续和胶孔径大小不连续：启动时Cl¯解离度大，Pro¯解离度居中，甘 aaCOO¯解离度小，迁移顺序为（pH6.8）Cl¯> Pro¯ >—COO¯。在 Cl¯与 Pro¯之间和 Pro¯与—COO¯之间都将出现低离子区，同时也出现高电势，高电势迫使 Pro¯向 Cl¯迁移，—COO¯向 Pro¯迁移。如：一个 Cl¯领路，—COO¯推动，蛋白在中间，这样就起到浓缩的作用了。在浓缩胶运动中，由于胶联度小，孔径大，Pro¯受阻小，因此不同的蛋白质就浓缩到分离胶之上成层，起浓缩效应，使全部蛋白质处于同一起跑线上。当蛋白质进入分离胶时，此时Pro¯，Cl¯，甘 aa 离子在 pH8.8 的溶液中，Cl¯完全电离而很快到达正极，甘 aa 电离度加大很快跃过蛋白质，而到达正极，只有蛋白质分子在分离胶中较为缓慢的移动。由于 Pro¯在电泳过程中，受到溶液离子的变化而 pH 值发生变化，但每一瞬间，其所带电荷数除以单位质量是不同的，所以带负电荷多者迁移快，反之则慢，这就现了电荷效应。由于胶孔径小，而且成为一个整体的筛状结构，它们对大分子阻力大，小分子阻力小，起着分子筛效应，也就是蛋白质在分离胶中，以分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异，最终达到彼此分开。
PAGE 胶的聚合原理：甲叉双丙烯酰胺和丙烯酰胺在过硫酸胺的作用下聚合，形成胶。
SDS聚丙烯酰胺凝胶的分离范围：
| 丙烯酰胺浓度（％） | 线性分离范围（KD） |
|---|---|
| 15 | 10～ 43 |
| 12 | 12～ 60 |
| 10 | 20～ 80 |
| 7.5 | 36～ 94 |
| 5.0 | 57～212 |
快速染色法
该方法我在博士期间测试过，的确可以使用，但是因为配置过程过于麻烦，而且最终效果实际上并没有传统的染色法清晰，因此就没有使用。大家处于兴趣可以尝试一下。
配置试剂
Fast A
称取0.5 g考马斯亮蓝R-250溶解到250 mL异丙醇中，加入100 mL乙酸，650 mL蒸馏水。
Fast B
称取0.05 g考马斯亮蓝R-250溶解到100 mL异丙醇中，加入100 mL乙酸，800 mL蒸馏水。
Fast C
称取0.02 g考马斯亮蓝R-250溶解到100 mL乙酸，加入900 mL蒸馏水。
Fast D
100 mL乙酸，900 mL蒸馏水。
染色过程：
1、将PAGE胶放到脱色盒里面，加入Fast A没过PAGE胶，微波炉加热~2 min，直至脱色液煮沸。
2、室温震荡5 min，将Fast A倒掉，加入蒸馏水漂洗一次。
3、向脱色盒里面加入Fast B，微波炉大火加热~1.5 min直至脱色液沸腾。
4、倒掉Fast B，用蒸馏水漂洗一次。
5、加入Fast C，微波炉大火加热~1.5 min直至脱色液沸腾。
6、室温震荡15 min，倒掉Fast C，用蒸馏水漂洗一次。
7、加入Fast D，微波炉大火加热~1.5 min直至脱色液沸腾。
8、室温震荡脱色，此时大部分条带应该能够看清。
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