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主笔：赵书雪、于浩
注意事项
1、本方法适合于酵母单菌落、蘑菇菌丝、蘑菇子实体、蘑菇晒干子实体等真菌样品的菌液PCR。
2、取蘑菇菌丝时，菌丝要求极少即可（肉眼看见就行），不要加入培养基；取蘑菇子实体时，用镊子取少量于离心管中，裂解时间可以适当加长；裂解酵母细胞时，肉眼看见浑浊即可，菌体不宜过多；晒干样品取组织的时候要尽量磨碎再加入。用冻干的样品来检测效果明显好于晒干的样品。样品处理方法对最终效果的影响实际上跟基因组提取一样。
3、金属提前打开设置到99摄氏度（使用水浴锅一定要防止进水造成污染）。
4、离心管加热过程，盖子容易崩开，必须要加离心管夹。
一、实验准备
1、细胞裂解液（配方详见：常见缓冲液配置方法）
2、Taq酶，无菌超纯水，引物
3、移液枪、吸头、0.5 mL离心管（1.5 mL也行）、冰盒
4、金属浴，PCR仪
二、实验步骤
所有步骤必须要更换吸头，养成习惯，加相同的溶液，加ddH2O也要换吸头。
1、加入50 μL 细胞裂解液至0.5 mL离心管中（如果没有用1.5 mL离心管也行）（样品多可以多加点裂解液，如果使用1.5 mL离心管建议加50 μL）。
这里不使用0.2 mL离心管是因为没有0.2 mL离心管配套的离心管夹（防爆夹），并不是0.2 mL离心管不可以使用。
2、取待裂解样品少许至细胞裂解液中。
如果样品有冻干的粉末，最好用冻干的粉末，如果没有冻干的粉末，只有子实体，可以用砂纸进行研磨，将新的砂纸剪成1cm * 2cm的小块，在一片新的打印纸上面用砂纸研磨蘑菇样品，研磨出粉末，将粉末加入到裂解液中。砂纸和打印纸都是一次性的。
注意不要加太多的样品，样品中有多糖，加入太多的样品就呈果冻状了。
3、将离心管夹夹到离心管上面，将离心管放于金属浴中，99摄氏度反应25 min，中间取出快速涡旋混匀2次，防止菌体沉淀裂解不完全。
4、25 min后，取出离心管，裂解液即为基因组模板，可以10000 rpm离心2 min，取上清进行DNA扩增。
5、按照25~30 μL 体系加入1 μL 的基因组模板，进行PCR。
6、ITS检测PCR方法和结果读取可以参考方法《食用菌分类与鉴定：ITS测序与系统进化分析》。
节选部分如下：
ITS序列的PCR扩增
1、在扩增ITS序列的时候建议直接用菌丝进行“食用菌菌丝菌落PCR”，具体方法参考链接内容，使用的引物为ITS1和ITS4，具体的序列可以参考“常用质粒和通用引物列表”，扩增利用Taq酶进行扩增即可，下面简单的列出来了一个PCR扩增方案，具体的方法建议参考其他教程。
| 实验组/μL | 阴性对照/μL | |
|---|---|---|
| 2 x Taq酶 Mix | 12.5 | 12.5 |
| ddH2O | 12 | 12 |
| ITS1引物（10 μM） | 1 | 1 |
| ITS4引物（10 μM） | 1 | 1 |
| Template | 1 | – |
| 总体积 | ~25 | ~25 |
| 步骤 | 温度 | 时间（min） |
|---|---|---|
| 1 | 95℃ | 5 min |
| 2 | 95℃ | 15 s |
| 3 | 58℃ | 20 s |
| 4 to 2（共35个循环） | 72℃ | 40 s |
| 5 | 16℃ | ∞ |
2、ITS扩增的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
3、如果电泳条带明亮、单一，跟DNA Marker比较大小在~600 bp，阴性对照无条带（有可能会因为污染等问题造成微弱条带），说明扩增的结果是正确的。
4、将PCR扩增产物送到公司进行测序。
实验记录
- 样本信息____
- 样本类型____
- 加入裂解液体积____
- PCR反应体积____
- 引物名称____
- 裂解完成是否关闭水浴锅____
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