ITS序列是内源转录间隔区（Internally Transcribed Spacer），位于真菌18S、5.8S和28S rRNA基因之间，分别为ITS 1和ITS2。
在真菌中，5.8S、18S和28S rRNA基因具有较高的保守性，而ITS由于承受较小的自然选择压力，在进化过程中能够容忍更多的变异，在绝大多数真核生物中表现出极为广泛的序列多态性。同时，ITS的保守型表现为种内相对一致，种间差异较明显，能够反映出种属间，甚至菌株间的差异。并且ITS序列片段较小（ITS 1和ITS 2长度分别为350 bp和400 bp），易于分析，目前已被广泛用于真菌不同种属的系统发育分析。
ITS测序分析基本流程
- 利用通用ITS测序引物（ITS1和ITS4）以菌丝作为模板进行菌落PCR扩增，并进行测序。如果能够提取基因组之后再以基因组作为模板进行ITS扩增效果更好。
- 对测序峰图进行分析，并决定是否连接载体进行单克隆测序。【重点！】
- 绝对测序结果进行整理，去除不准确信息。
- 利用软件进行系统进化分析（具体参考“”）
一、ITS序列的PCR扩增
1、在扩增ITS序列的时候建议直接用菌丝进行“食用菌菌丝菌落PCR”，具体方法参考链接内容，使用的引物为ITS1和ITS4，具体的序列可以参考“常用质粒和通用引物列表”，扩增利用Taq酶进行扩增即可，下面简单的列出来了一个PCR扩增方案，具体的方法建议参考其他教程。
| 实验组/μL | 阴性对照/μL | |
|---|---|---|
| 2 x Taq酶 Mix | 12.5 | 12.5 |
| ddH2O | 12 | 12 |
| ITS1引物（10 μM） | 1 | 1 |
| ITS4引物（10 μM） | 1 | 1 |
| Template | 1 | – |
| 总体积 | ~25 | ~25 |
| 步骤 | 温度 | 时间（min） |
|---|---|---|
| 1 | 95℃ | 5 min |
| 2 | 95℃ | 15 s |
| 3 | 58℃ | 20 s |
| 4 to 2（共35个循环） | 72℃ | 40 s |
| 5 | 16℃ | ∞ |
2、ITS扩增的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
3、如果电泳条带明亮、单一，跟DNA Marker比较大小在~600 bp，阴性对照无条带（有可能会因为污染等问题造成微弱条带），说明扩增的结果是正确的。
4、将PCR扩增产物送到公司进行测序。
二、ITS测序峰图分析
1、第1种情况：是全部是单峰（两边测不准的区域不算）
这种情况最简单，只要按照下面的数据处理去掉不准确的区域就行了，也是我们最希望看到的情况。
2、第2种情况：存在SNP位点
大部分担子菌食用菌细胞内都存在两个不相容的细胞核，属于异核二聚体，这两个细胞核的ITS序列有可能不同，不同菌株两个核的ITS不同的概率不同。（当然也不能完全排除一个核内多个拷贝的ITS序列不同的情况）这种不同有可能是SNP位点，也有可能是存在InDel位点。如果是单核苷酸的差异，在测序峰图上面就会出现下面的这种情况。
如果整个序列只有一个SNP位点，这种情况相对简单，比如说这里的SNP位点是C/T位点。那么就把ITS由一条变为两条，一条这里是C，记为ITS-a，另一条这里是T，记为ITS-b。
如果出现多个SNP位点，根据单纯的测序肯定测不准（只能猜测其中一条的峰永远高一点，但是这点不能确定），在这种情况下如果要获得准确的两条ITS序列，必须要链接载体进行单克隆的测序（参考步骤五）。
3、第3种情况：出现套峰
如果两个ITS的差异不是由SNP导致的而是由InDel导致的，那么测序峰图就会出现套峰。
套峰产生的原因跟前面的SNP一样，具有下面几个特点：1、套峰总是两个不同类型的碱基峰套在一起；2、连续多个相同的碱基峰不会出现套峰；3、每个套峰的其中一个碱基总是在前面1个位点（缺失1个），少数在两个位点前面会找到相同的碱基峰。
如果出现了套峰，那么可以选择不重叠的前端的测序部分进行简单的物种分析，但是ITS的完整结果不能用于序列分析，需要按照第五步进行”连接载体筛选单克隆进行测序“，并且要保证能够测到两种不同序列的存在InDel变异的ITS序列。将两条序列分别命名为ITS-a和ITS-b进行后面的系统进化分析。
4、第4种情况：杂峰
如果出现多重套峰的杂峰，应该是样品污染或者测序的问题，可以重新进行ITS扩增后送测序。如果还出现这种情况，则需要将菌种进行纯化后重新扩增ITS送测序。如果反复出现这种情况，又排除了菌株污染问题，也可以按照第五步进行”连接载体筛选单克隆进行测序“，多测一些单克隆，查看一下是否存在两种以上的ITS序列。
三、ITS测序数据处理
1、如果是连接载体进行单克隆测序
建议保留ITS1和ITS4两条引物中间的所有序列，删除掉ITS1和ITS4自身的序列。
2、去掉前后测不准的区域
由于ITS序列长度只有~600 bp，因此一次测序反应就可以把全长测通，本着节约科研经费的原则，建议单端测序。
由于毛细管电泳自身的局限性，前端和后端都有测不准的区域。前端可以找一个你自己认为准确的峰作为起始碱基，宁可序列短一点，不要保留不确定的峰，因为如果因为不确定峰导致了产生多样性，这种多样性是假的。
后端的原则跟前端一样，找一个你自己认为准确的峰作为起终止碱基，宁可序列短一点，不要保留不确定的峰。
四、系统进化分析
1、将处理好的序列整理成为fasta格式的文件，放到一个文本文档中。
2、将序列进行多序列比对和系统进化分析。
如果序列数量不多，建议直接用MEGA来进行分析，具体参考：“多序列比对和系统进化分析：利用MEGA进行多序列比对和进化分析”。
如果序列数量多，可以利用服务器来进行序列分析和系统进化分析，具体可以参考：“xxxxxxxx”。
需要注意的是如果序列的来源不是单克隆测序得到的序列（扣除ITS1和ITS4序列之间的所有序列），那么由于测序质量不同会导致两端的序列的长度不同，如果不同的ITS序列之间相差显著，这种ITS长度的不同通常不会造成显著影响。也就是说，ITS长度的不同并不会影响分类学的鉴定。但是如果做同一个物种内部不同的个体之间的ITS的差异，由于不同个体的ITS本身差异很小，那么由于测序长度不同导致的差异就会影响比对结果。长度相同而且匹配的更容易聚到一起。在这种情况下，如果我们想要获得准确的结果，最好的办法就是所有的ITS序列都采用单克隆测序来做，当然由于这种办法太费时费力，可以按照下面的方法，在MEGA中完成多序列比对之后，把末端不齐的序列给删除掉。
（我们在这里不考虑全基因组重测序的分类方法，因为重测序也有自身的问题，在其他教程中讨论）
五、连接载体对单克隆进行测序（选做）
敬请期待
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