说明
- 氯化钙方法制备感受态细胞方法比较简单，但是制备出高效率的感受态细胞比较困难，因此本方法不追求高转化率，只要制备出来的感受态细胞能够成功转化完整质粒即可，因此适用于制备E. coli BL21(DE3)细胞的感受态，用于重组质粒蛋白表达的实验。
- 因为转化完整载体，因此转化过程也可以简化，在本方法后面会列出来一个转化完整质粒的简化后的转化方法，仅用于完整质粒向大肠杆菌热激感受态的转化，不得用于克隆过程中的转化和其他的宿主细胞的转化。
一、实验准备
1、LB培养基：
100 mL（500 mL三角瓶），2瓶。
10 mL（50 mL三角瓶）6瓶
LB平板（无抗性）2个
2、CaCl2-MgCl2溶液：（CaCl2 20 mM，MgCl2 80 mM）
准确称取0.294 g 氯化钙二水和1.626 g氯化镁六水，加入到用超纯水洗干净的250 mL的三角瓶中，加入100 mL超纯水将试剂溶解，分装50 mL到另一个洗干净的250 mL的三角瓶中，高压蒸汽灭菌。
3、氯化钙甘油溶液：5 mL
准确称取0.368 g的氯化钙二水加入到洗干净的50 mL离心管中，加入21.2 mL超纯水溶解氯化钙。取出4.25 mL氯化钙溶液加入15 mL的洗净的螺口离心管中，加入0.75 mL的甘油，涡旋混匀，高压蒸汽灭菌。
4、2 M MgCl2：
-20℃公用冰箱，用储藏液高压蒸汽灭菌后分装，每管分装1 mL。
5、1.5 mL离心管40 个，50 mL离心管8个，高压蒸汽灭菌。
二、注意事项
1、全程都要保持低温。
2、要严格无菌操作，否则会影响后续实验。
3、感受态细胞制备过程不要用移液枪悬浮细胞，轻甩离心管悬浮，动作要轻柔。
4、转化过程不要用移液枪悬浮细胞，动作要轻柔。
三、实验步骤
1、从冰箱将冷冻保存的E. coli BL21(DE3)菌株的甘油管取出放在冰上，在甘油管化冻之前，迅速挑取顶部的菌块少许加入到2瓶10 mL的LB培养基中。将LB培养基放在37℃下过夜培养。
2、将变浑浊的E. coli BL21(DE3)培养液在LB平板上面三区划线（划2个平板，不要加抗性）。
3、挑取单菌落2个到2个10 mL的LB培养基中（不需要加入抗生素），过夜培养。
4、选取一个长势良好的菌液作为种子（注意闻味道），接种0.5 mL到100 mL的LB培养基中，加入1 mL的2 M MgCl2溶液（提前取出在超净台中化冻，将冷凝水晾干，紫外灭菌）。
平行做2瓶，一瓶对照专门用于测OD600，另一瓶用于制备感受态细胞。
同时接种0.2 mL种子液到2瓶10 mL的LB培养基里面，分别加入Kan和Amp抗性。
如果第二天菌液变浑浊，说明种子污染了，就不要做后续的实验和验证了，如果没有变浑浊，说明种子没有问题。
5、37°C剧烈振荡培养2-5 h（37°C 180-220 rpm），直至OD600长至0.35~0.4。期间看到浑浊后就可以取出对照瓶，在超净台中迅速取出1 mL测定OD值。
6、 将装有的CaCl2-MgCl2溶液的三角瓶放在冰上预冷。取出测OD的对照瓶测定OD600值，生长至0.35~0.4时，将另一瓶培养物拿到超净台中，向其中加入50 mL的预冷的CaCl2-MgCl2溶液。将混合培养物放在冰水混合物中，缓慢晃动三角瓶，使培养物冷却至0 °C。
7、 将培养物准确分装到50 mL的离心管中，4°C，5000 rpm × 10 min，弃上清，尽量将液体去除干净。
8、利用剩余的50 mLCaCl2-MgCl2溶液重选大肠杆菌沉淀，将重选后的离心管放在冰上静置10 min。
9、 4°C，5000 rpm × 10 min，弃上清，将离心管倒置1 min（管口一端放在超净台上，另一端放在离心管盖上）。
10、 利用2 mL的预冷的氯化钙甘油溶液重选细胞沉淀。
11、将氯化钙溶液分装到-20℃预冷的1.5 mL的离心管中，每管分装80 μL，无需液氮速冻，直接将感受态直接放到-80摄氏度冰箱中保存，在冻存盒上面标记好感受态制备时间（可以分装~30管）。
12、第二天取出2个感受态细胞，1支感受态转化pET28a空载体，并涂布含有Kan抗性的LB平板，查看感受态细胞是否制备成功；另一个感受态细胞不添加质粒，也按照下面的步骤进行转化，并涂布含有Kan抗性的LB平板，观察是否存在污染。
四、完整质粒转化步骤
1、取出1支感受态细胞，放在冰上溶解。（取出平板37度预热）
2、加入完整质粒，轻弹离心管，使得DNA与感受态细胞混合均匀。
3、冰浴15 min。
4、42℃热激90 s，迅速将离心管转移到冰浴中2 min。
5、加入500 μL的LB培养基（放在-20摄氏度公共冰箱，灭菌后分装，每管1 mL）。
6、直接取100 μL的混合液涂布到含有相应抗性在37℃预热后的LB平板上，倒置平板，37℃过夜培养。
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