原创内容，欢迎转载，转载请注明出处
注意事项
-
序列比对是生物信息学最基础的工作，很多工作都是基于序列比对进行的。序列比对分为局部比对和全局比对，局部比对最经典的就是Blast，也就是本文介绍的内容，全局比对多用于多序列比对，比如说clustal、Muscle、Mafft等工具，这部分内容可以查看网站其他部分的教程。
-
局部比对最常用的工具就是Blast，此外还有很多其他的工具，比如说速度远远快于Blast，用于进行蛋白序列比对的Diamond，中国科学院北京基因组研究所基因组科学与信息重点实验室“百人计划”章张研究员开发的ParaAT，另一个代替blast的工具MMSeq2，用于结构域比对的Hammer，三代测序长reads比对的Minimap2，用于二代测序reads比对的BWA、Bowtie2等。
-
虽然序列比对的工具有很多，但是对于我们这样一个非生物信息学团队而言，大家能够接触到的数据量并不大，Blast完全可以解决大部分的序列比对需求，所以只需要学会并熟悉Blast的基本功能即可。
-
同样，由于比对的需求不大，因此完全可以将Blast安装到本地来使用，由于windows10和windows11的命令行工具越来越好用了，因此，建议大家将Blast安装到本地，在自己的电脑上进行Blast比对。当然也可以到实验室的服务器上面进行比对，比对的结果是完全一致的。
-
在版本上面大家尽量安装最新的版本。
一、Blast在windows上安装使用
1、程序下载
访问blast本地软件包链接 blast_latest ，下载适合自己系统的blast版本。
如果下载速度太慢，可以到实验室的服务器上下载，服务器上面有两个版本分别是：ncbi-blast-2.2.28±win64 和 ncbi-blast-2.14.0±x64-win64，两个版本对于我们这些初级的使用者而言没有区别。
2、安装流程
如果下载以win64.exe结尾的文件，则需要双击安装。如果是以win64.tar.gz结尾则是绿色版本，解压后就可以使用。
安装（或者解压缩）后会生成bin和doc两个子目录，其中bin是程序目录，doc是文档目录，这样就安装完成。
路径中有中文是否会影响运行并不清楚，但是按照习惯还是尽量不要出现中文。
3、添加环境变量
建议直接在百度上搜索方法，这里简单的说一下步骤。
右键点击“我的电脑”-属性，然后点击“高级系统设置”，点击“环境变量”，在用户变量下方点击“Path”这一行，点击下面的“编辑”，点击“新建“，把blast安装的的bin目录的路径拷贝粘贴到里面就行了，最后一路点击”确定。就可以了。
4、测试是否安装配置成功
在windows中，点击“Win+R”在出现的运行窗口中输入cmd或者powershell都可以打开命令行。建议使用powershell，因为powershell的命令跟linux系统的命令一样，如果熟悉了powershell的命令，在后面如果需要使用linux服务器的时候更好上手，如果使用的是cmd命令行，则需要熟悉dos命令，增加了学习成本。
如果安装配置完成，只要打开cmd命令窗口和powershell命令窗口，输入“makeblastdb”，如果出现USAGE，并且出现用法，则说明安装成功了（见下图），如果直接显示Error，则说明安装失败，大概率是环境变量配置的问题。
二、Blast使用：本地数据库的建立（数据库格式化）
Blast的详细用法和详细参数请参考网上其他的Blast使用手册，Blast的高级用法我们通常使用不到，我们最常用的就是用blast来寻找同源序列。因此这里就只介绍最简单的使用方法。
进行Blast比对的时候，不能直接比对fasta格式，必须将想要作为比对对象的一方进行格式化（制作成为数据库），用另一方（fasta格式）与数据库进行比对。
这时我们首先需要使用到makeblastdb程序来格式化。
makeblastdb程序的使用方法如下：
makeblastdb -in dna-database.fasta -out dnadb -dbtype nucl
这里的dna-database.fasta是被比对的数据，里面的序列必须是fasta格式。
dnadb是生成的数据库的名字，这个名字可以随便起，比对的时候会用到这个名字。
-dbtype nucl 代表的是数据库是DNA序列，nucleotide的前面4个字母，如果数据库序列是蛋白序列则后面应该跟着prot（protein前面4个字母）。
下面就是构建蛋白数据库的命令：
makeblastdb -in pro-database.fasta -out prodb -dbtype prot
这里的pro-database.fasta是被比对的数据，里面的序列必须是fasta格式。
prodb是生成的数据库的名字，这个名字可以随便起，比对的时候会用到这个名字。
-dbtype prot 代表的是数据库是DNA序列，nucleotide的前面4个字母，如果数据库序列是蛋白序列则后面应该跟着prot（protein前面4个字母）。
三、Blast使用：DNA序列与DNA序列比对 blastn
实例：
我们通常用来进行ITS测序的引物是ITS1和ITS4，当我们送到公司测序的时候，由于测序质量不同会导致无法完全准确的获取ITS1引物和ITS4引物之间的序列。（具体原因可以查看：食用菌分类与鉴定：ITS测序与系统进化分析）
但是如果我们有单核菌丝的全基因组测序数据，我们就可以用序列比对的方法寻找目标菌株的完整的ITS序列。
本教程以来自于平菇的ITS序列，用来寻找猪肚菇上面的ITS序列。
下面是blastn工具进行序列比对的过程，首先用makeblastdb工具格式化基因组，生成数据库，再用blastn进行比对。-query后面跟着查询序列的文件名称，序列需要是fasta格式的文本文档，文件以什么结尾都可以。-db跟着格式化好的数据库的名字，-out后面跟着要输出的文件名称；-outfmt 6代表利用第6种格式输出，也就是表格格式(tabular)，生成的实际上是文本文档，即使这里使用xlsx结尾，生成的还是文本文档，只不过以xlsx结果可以直接双击用表格打开，比较省事。其他输出格式自己百度学习。
-evalue 1e-5是设置一个比对的阈值，只保留可信度高于这个阈值的结果，具体应该用什么值自己设置。
# 创建数据库
makeblastdb -in Pgig.genome.fa -out genome -dbtype nucl
# 利用blastn进行DNA序列与DNA序列比对
blastn -query Post-ITS.fa -db genome -out result.xlsx -outfmt 6 -evalue 1e-5
双击result.xlsx打开比对结果，可以看到表格一共12列，在不同的contig上面有很多个ITS的拷贝。
每一列的含义如下：
query id：查询序列ID标识;
refer id：参考序列ID标识;
identity (%)：序列比对的一致性百分比;
alignment length：符合比对的比对区域的长度;
mismatches：比对区域的错配数;
gap openings：比对区域的gap数目;
q.start：比对区域在查询序列(query id)上的起始位点;
q.end：比对区域在查询序列(query id)上的终止位点;
s.start：比对区域在参考序列(refer id)上的起始位点;
s.end：比对区域在参考序列(refer id)上的终止位点;
e-value：比对结果的期望值，将比对序列随机打乱重新组合，和数据库进行比对，如果功能越保守，则该值越低；
bit score：比对结果的bit score值;
四、Blast使用：蛋白序列与蛋白序列比对 blastp
小任务：
萎锈灵carboxin抗性是食用菌遗传转化中常用的一个抗性基因，利用carboxin抗性进行筛选假阳性率低，筛选效果好。carboxin抗性就是succinate dehydrogenase蛋白复合体上面的iron-sulfur亚基的突变体。琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环的重要功能部分，由四个亚基构成，分别是黄素蛋白(Fp， SdhA)、铁硫蛋白(Ip， SdhB) 和两种嵌膜蛋白( SdhC和SdhD) 。当琥珀酸脱氢酶B亚基的一个组氨酸(His)突变为亮氨酸(Leu)之后对于萎锈灵敏感性降低，但是仍然能够保持琥珀酸脱氢酶的活性。
本教程以来自于杏鲍菇的CbxR cassette序列作为query序列，用来寻找大球盖菇上面的同源序列。该序列可以利用点突变构建大球盖菇专用的CbxR基因。
由于核酸序列并不保守，蛋白序列相对保守，因此我们应该用杏鲍菇的iron-sulfur基因来对比大球盖菇的iron-sulfur序列，再利用多序列比对来寻找应该突变哪一个位点。
下面是我从网上找的杏鲍菇Pleurotus eryngii ATCC 90797的琥珀酸脱氢酶B亚基的基因序列和蛋白序列，如果要改造成为cbxR基因，需要修改的位点我已经在下面比较出来了。
>KAF9489857
ATGCAGGCGCTCACCTCCAGGTCGTTGGCTCGCTCATCCCGCTCGATTCGTGCTTTCTCCACCTCGTGTGGAAGGTGGCAGGCTGAGCCCCTTCAGAAGCCCGTTCTCCAGAAAGAATTCAAGATCTACCGTTGGAATCCGGATGAACCAGCCAAGAAGCCTCATCTCCAATCGTACACTATTGACTTGAACCAGACGGGCCCCATGATTTTGGATGCTCTTATCAAGATCAAGAACGAAATCGATCCTACGCTCACATTCCGTCGTTCGTGCAGAGAGGGGATTTGCGGCTCGTGCGCGATGAATATTGACGGACAGAACACGCTGGCTTGCCTGTGCCGAATTGACCGTAACGCCAGCAAGGACAGCAAGATCTACCCTTTGCCGCACATGTACATCGTGAAAGACCTCGTACCCGACCTCACGCTTTTCTACAAGCAGTACAAGTCCATCAAGCCTTACCTGCAGAACGACAATGTCCCCGAGAGGGAGCACCTCCAGTCGCCAGAGGACCGCAAGAAGCTGGACGGGATGTATGAATGCATCCTGTGCGCGTGCTGCAGCACATCGTGCCCCAGCTATTGGTGGAACCAAGATGAGTATTTGGGACCAGCTGCTTTGATGGCCGCGTATAGGTGGATTGCGGACTCACGAGATACGTATGGCGCACAACGCAAGGAACATTTCCAGAATGAGATGAGTTTGTTCCGCTGCCAC(CTC)ACCATCTTCAATTGCTCTCGCACTTGTCCAAAGGGCCTCAACCCTGCGAAAGCCATTGCAGAGATCAAGCTCGCGCTTGCTACGGAGTAA
>KAF9489857 iron-sulfur protein subunit
MQALTSRSLARSSRSIRAFSTSCGRWQAEPLQKPVLQKEFKIYRWNPDEPAKKPHLQSYTIDLNQTGPMILDALIKIKNEIDPTLTFRRSCREGICGSCAMNIDGQNTLACLCRIDRNASKDSKIYPLPHMYIVKDLVPDLTLFYKQYKSIKPYLQNDNVPEREHLQSPEDRKKLDGMYECILCACCSTSCPSYWWNQDEYLGPAALMAAYRWIADSRDTYGAQRKEHFQNEMSLFRCH(L)TIFNCSRTCPKGLNPAKAIAEIKLALATE*
这里需要做的就是利用杏鲍菇iron-sulfur蛋白序列，与大球盖菇的预测的所有的蛋白序列进行比较，找到大球盖菇琥珀酸脱氢酶的iron-sulfur亚基的蛋白序列，再找到对应的cds序列和基因组上面的位置。取ATG上游的~1500 bp序列和下游的~300 bp序列作为cbxR cassette，将其中的H突变为L就行了。
# 创建数据库
makeblastdb -in revised_proteome.fa -out proteome -dbtype prot
# 利用blastn进行DNA序列与DNA序列比对
blastp -query PecbxR.fasta -db proteome -out result.xlsx -outfmt 6 -evalue 1e-3
双击result.xlsx打开比对结果，可以看到比对到了一个蛋白，这个蛋白很有可能就是我们的目标蛋白。需要进一步用实验进行验证。
五、Blast使用：blastx、tblastn与tblastx
其他的几个blast程序的使用方法自学。
评论区