PCR产物回收（试剂盒法）

注意事项

• PCR和酶切产物回收与切胶回收相比较操作步骤少，时间短，无需电泳就可以直接从PCR产物和酶切产物中回收DNA片段，同时最大程度的去除蛋白质、离子、引物小片段等杂质。直接回收可以回收50 bp~20 kb的DNA片段。

• 必须要清楚什么时候使用切胶回收，什么时候使用直接回收的方法，如果选择不当，会显著影响后续实验结果，浪费更多的时间。

• 如何判断什么时候使用直接回收，什么时候切胶回收？一种简单的判断方法就是，假设一下体系中所有的DNA（模板DNA序列、引物、引物二聚体、引物非特异性扩增片段、未充分扩增片段、未彻底酶切载体等）保留在体系中，会不会影响后续实验。如果不影响，则可以使用PCR产物回收方法，如果能够影响则不能使用。

例如

如果PCR产物要进行一步克隆，里面的非特异性扩增，引物二聚体等也会跟载体连接，这个时候就需要切胶回收，不能直接回收。

酶切产物不能进行直接回收，因为里面没有彻底酶切的载体会作为假阳性影响后续的实验结果，酶切下来的小片段更容易与载体链接，造成假阳性。

PCR产物要进行双酶切，则可以直接进行产物回收，因为其他DNA不影响酶切过程，可以酶切后再进行切胶回收。

• 因为PCR产物回收使用场景有限，因此我们不再购买专门的试剂盒，而是直接采用”胶回收试剂盒“来进行PCR产物回收。

一、实验准备

1、生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒（B518131） 或 Vazyme FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit（DC301-01）

2、无菌超纯水

3、1 mL 移液枪，200 μL 移液枪，移液枪头

4、金属浴

二、实验步骤

1、如果PCR回收产物的体积在50~150 μL，向其中加入500 μL的Buffer B2，将缓冲液与DNA充分混匀；

2、将样品转移到吸附柱中，9,000 × g 离心30 sec，倒掉下面收集管中的液体，再将吸附柱放到收集管中；（如果体积超过700 μL，则需要分批加入吸附柱中，另外如果想进一步提高DNA的回收效率，可以将收集管中的液体再一次加入到同一吸附柱中离心。）

3、向吸附柱中加入300 μL Buffer B2，9,000 × g 离心30 sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

4、向吸附柱中加入500 μL Wash Solution，9,000 × g 离心30 sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。（一定要检查Wash Solution是否打钩，如果没有打钩质粒会被冲洗掉，加入乙醇后打钩）

5、重复步骤4一次。

6、取1 mL无菌水，放到1.5 mL离心管中，置于60℃金属浴中预热。

7、将空吸附柱，10,000 × g 离心2 min ，倒掉收集管中的液体。打开吸附柱上盖，在超净台中吹5 min，使硅胶模上面的乙醇挥发掉。（在超净台中干燥时注意不要开紫外灯）

8、将吸附柱放到一个新的1.5 mL新离心管中（一定要用一个新的离心管，最好是灭过菌没有水气的离心管，毕竟回收过程没有无菌操作，污染杂菌可能会影响后续的转化步骤）在吸附膜中央加入30-40 μL预热后的无菌水，金属浴中静置2 min，9,000 × g离心1 min。将所得到的质粒DNA 溶液置于-20℃ 保存或用于后续试验。

加入预热的无菌水时注意要将水垂直加到吸附膜中央，不要直接加到吸附柱壁上，不然只有部分膜被水洗脱，会降低回收率

三、Check Lists

• 使用的试剂盒的公司和货号____
• 样品类型和样品来源____
• 回收样品体积___
• 加入溶胶液（B2)的体积____
• 洗脱液是（通常为ddH2O）____
• 洗脱液的体积____
• 洗脱后的DNA的浓度（超微量测量）____

其他

PCR产物回收试剂盒的原理就是将DNA结合到离心柱内的硅胶膜上。结合所得的DNA经过洗涤后，再在所选的缓冲液中洗脱所得的洁净、浓缩的DNA。每个离心柱一半至多可纯化100 μL或10 μg经PCR扩增的DNA（也有的公司说可以回收40 μg的DNA），有报道称可以回收50 bp~20 kB的片段，主要回收100 bp至10 kb大小的DNA片段。