质粒小提（试剂盒法）

说明

本实验方案是从大肠杆菌中提取质粒，其他的宿主细胞不适用。

1、试剂盒（位于试剂盒架子上，不含Buffer P1）：Vazyme FastPure® Plasmid Mini Kit（货号DC201）、生工 SanPrep 柱式质粒 DNA 小量抽提试剂盒（货号：B518191）

2、Buffer P1（位于公共冰箱4摄氏度）

3、1.5 mL离心管（普通离心管即可，最好事先进行灭菌）

4、超纯水（最好灭菌）

5、离心机、水浴锅、超微量分光光度计

6、菌株培养准备：灭菌的15 mL离心管，LB平板（含有特定的抗生素），灭菌后的LB培养基（公共冰箱4摄氏度）

1、每次都要从单菌落开始，画好的单菌落的平板可以在公共冰箱4摄氏度放2个月，如果没有单菌落平板或者超期则需要从划单菌落开始，划单菌落参考其他教程。

2、每个步骤都要更换枪头，千万不要造成污染。

3、Buffer P1和Wash Solution（PW2）使用前检查是否打钩，没有打钩则加上响应试剂后打钩。

4、完成试验后Buffer P1放到4 ℃ 冰箱。

1、用灭菌枪头挑取1个单菌落，加入到含有合适的抗生素的10 mL LB液体培养基中（统一配置），于37℃摇床充分振荡培养15-20 h。

具体的质粒与抗生素对应关系请查看下面的连接：常用质粒抗性

2、每次取1~1.5 mL菌液加入到1.5 mL离心管中，室温，10,000 × g 离心1 min，丢掉上清，继续加菌液，最终离心~5 mL的菌液（低拷贝质粒可以超过5 mL，超过5 mL可能要增加试剂的使用量，会超过1.5mL离心管的容积）。

3、在菌体沉淀中加入250 μl Buffer P1，吸打或振荡至彻底悬浮菌体。【一定要检查P1是否打对勾，如果没有需要加入RNase A并打对勾】

4、加入250 μl Buffer P2，立即温和颠倒离心管5-10次混匀，室温静置1 min。

5、加入350 μl Buffer P3，立即温和颠倒离心管5-10 次充分混匀。

6、13,000 × g离心5 min，将上清全部小心移入吸附柱，静置1 min；9,000 × g离心30 sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

7、向吸附柱中加入500 μl Wash Solution（PW2），9,000 × g 离心30 sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。【一定要检查Wash Solution是否打钩，如果没有打钩质粒会被冲洗掉，加入乙醇后打钩】

8、重复步骤7 一次。

9、将空吸附柱和收集管放入离心机，10,000 × g 离心2 min 。打开吸附柱上盖，在室温晾5 min，使硅胶模上面的乙醇挥发掉。

10、取1 mL超纯水，放到1.5 mL离心管中，置于60摄氏度水浴锅中预热。

11、将吸附柱放到一个新的1.5 mL新离心管中【一定要用一个新的离心管，否则质粒污染不能使用】。在吸附膜中央加入60 μL预热后的超纯水，静置1-2 min，9,000 × g离心1 min。

12、利用超微量分光光度计检测提取的质粒DNA的浓度，并将浓度写在离心管上面，将所得到的质粒DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。

1、首次使用前请短暂离心RNase A，将试剂盒提供的RNase A溶液全部加入Buffer P1中，置于4℃保存。

2、首次使用前按Buffer PW2瓶子标签所示，加入适量的无水乙醇稀释Buffer PW2，于室温保存。

3、冬季，Buffer P2、Buffer P3和Buffer PW1溶液容易产生白色沉淀，使用前可室温放置一段时间，必要时可在37℃水浴锅中预热至沉淀完全溶解，混匀后再使用。

4、质粒提取得率和质量与宿主菌的种类、质粒拷贝数，质粒的稳定性等因素有关，根据质粒不同灵活调整离心菌液的体积。

5、Buffer PW1可以有效去除残留的蛋白污染，当宿主菌为endA+(TG1、BL21、HB101、ET12567、JM系列)等核酸酶含量较高的菌株时，必须使用Buffer PW1。