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主笔:于浩、李晓航
注意事项
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切胶回收的目的是去除DNA片段中的杂质和与目的片段长度不同的DNA片段,常用于回收“用于重组质粒构建的单酶切或者双酶切载体” “有杂带的PCR产物”等样本的目的片段的回收。
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切胶回收的回收率很低,因此如果能够不进行切角回收最好不要进行切胶回收。
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条带单一的PCR产物可以直接进行DNA片段回收,PCR产物双酶切之后的产物也可以直接进行DNA片段回收,如果要进行PCR片段回收请参考:DNA片段和PCR产物回收
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切胶时尽量切的小一点,防止引入其他杂质。
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为了获得更加单一的目的条带,电泳时可以延长电泳时间,让条带更加单一。
一、实验准备
1、生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(B518131)、Vazyme FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit(DC301-01)
2、无菌超纯水
3、1 mL 移液枪,200 μL 移液枪,移液枪头
4、金属浴
二、实验步骤
1、电泳,切胶,尽可能切的小一点,将切下来的凝胶放到一个新的1.5 mL离心管中(切胶尽量小,而且尽量保证每个片段切胶的大小是一致的,这样后面离心就不需要配平了。);
2、根据切胶量的大小,加入500 μL Buffer B2,不需要称重(根据经验,只要凝胶切的足够小就不需要称重);
如果切的胶块特别大需要根据试剂盒说明书调整B2量,但是过多的溶胶液无法一次离心会增加实验步骤,建议第一步切胶小一点。
3、50摄氏度,金属浴中加热5~10 min,期间每2 min颠倒几次离心管,观察里面的凝胶是否完全溶解;
注意一定要完全溶解没有胶块后再进行下一步,否则会影响后续实验步骤,对着光查看是否有固体,如果没有了说明溶解完全
4、将离心管放到冰上冷却至室温,也可以在室温冷却【不冷却结合效率会很低】;
5、将溶胶液转移到吸附柱中,9,000 × g 离心30 sec,倒掉下面收集管中的液体,再将吸附柱放到收集管中;
如果体积超过700μl,则需要分批加入吸附柱中,另外如果想进一步提高DNA的回收效率,可以将收集管中的液体再一次加入到同一吸附柱中离心。
6、向吸附柱中加入300 μL Buffer B2,9,000 × g 离心30 sec。倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同一个收集管中。
7、向吸附柱中加入500 μL Wash Solution,9,000 × g 离心30 sec。倒掉收集管中的液体,将吸附柱放入同一个收集管中。
一定要检查Wash Solution是否打钩,如果没有打钩质粒会被冲洗掉,加入乙醇后打钩
8、重复步骤7一次。
9、取1 mL无菌水,放到1.5 mL离心管中,置于60℃金属浴中预热。
10、将空吸附柱,10,000 × g 离心2 min ,倒掉收集管中的液体。打开吸附柱上盖,在超净台中吹5 min,使硅胶模上面的乙醇挥发掉。(在超净台中干燥时注意不要开紫外灯)
11、将吸附柱放到一个新的1.5 mL新离心管中(一定要用一个新的离心管,最好是灭过菌没有水气的离心管,毕竟回收过程没有无菌操作,污染杂菌可能会影响后续的转化步骤)在吸附膜中央加入40 μL预热后的无菌水,在金属浴中静置2 min,9,000 × g离心1 min。将所得到的质粒DNA 溶液置于-20 ℃保存或用于后续试验。
加入预热的无菌水时注意要将水垂直加到吸附膜中央,不要直接加到吸附柱壁上,不然只有部分膜被水洗脱,会降低回收率
Check Lists
- 使用的试剂盒是什么____
- Wash Solution是否打钩(加入乙醇)____
- DNA样品的信息____
- 使用的洗脱液是什么____
- 洗脱液的体积____
- 回收的DNA的浓度____
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