切胶回收（试剂盒法）

主笔：于浩、李晓航

注意事项

• 切胶回收的目的是去除DNA片段中的杂质和与目的片段长度不同的DNA片段，常用于回收“用于重组质粒构建的单酶切或者双酶切载体” “有杂带的PCR产物”等样本的目的片段的回收。

• 切胶回收的回收率很低，因此如果能够不进行切角回收最好不要进行切胶回收。

• 条带单一的PCR产物可以直接进行DNA片段回收，PCR产物双酶切之后的产物也可以直接进行DNA片段回收，如果要进行PCR片段回收请参考：DNA片段和PCR产物回收

• 切胶时尽量切的小一点，防止引入其他杂质。

• 为了获得更加单一的目的条带，电泳时可以延长电泳时间，让条带更加单一。

一、实验准备

1、生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒（B518131）、Vazyme FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit（DC301-01）

2、无菌超纯水

3、1 mL 移液枪，200 μL 移液枪，移液枪头

4、金属浴

二、实验步骤

1、电泳，切胶，尽可能切的小一点，将切下来的凝胶放到一个新的1.5 mL离心管中（切胶尽量小，而且尽量保证每个片段切胶的大小是一致的，这样后面离心就不需要配平了。）；

2、根据切胶量的大小，加入500 μL Buffer B2，不需要称重（根据经验，只要凝胶切的足够小就不需要称重）；

如果切的胶块特别大需要根据试剂盒说明书调整B2量，但是过多的溶胶液无法一次离心会增加实验步骤，建议第一步切胶小一点。

3、50摄氏度，金属浴中加热5~10 min，期间每2 min颠倒几次离心管，观察里面的凝胶是否完全溶解；

注意一定要完全溶解没有胶块后再进行下一步，否则会影响后续实验步骤，对着光查看是否有固体，如果没有了说明溶解完全

4、将离心管放到冰上冷却至室温，也可以在室温冷却【不冷却结合效率会很低】；

5、将溶胶液转移到吸附柱中，9,000 × g 离心30 sec，倒掉下面收集管中的液体，再将吸附柱放到收集管中；

如果体积超过700μl，则需要分批加入吸附柱中，另外如果想进一步提高DNA的回收效率，可以将收集管中的液体再一次加入到同一吸附柱中离心。

6、向吸附柱中加入300 μL Buffer B2，9,000 × g 离心30 sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

7、向吸附柱中加入500 μL Wash Solution，9,000 × g 离心30 sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

一定要检查Wash Solution是否打钩，如果没有打钩质粒会被冲洗掉，加入乙醇后打钩

8、重复步骤7一次。

9、取1 mL无菌水，放到1.5 mL离心管中，置于60℃金属浴中预热。

10、将空吸附柱，10,000 × g 离心2 min ，倒掉收集管中的液体。打开吸附柱上盖，在超净台中吹5 min，使硅胶模上面的乙醇挥发掉。（在超净台中干燥时注意不要开紫外灯）

11、将吸附柱放到一个新的1.5 mL新离心管中（一定要用一个新的离心管，最好是灭过菌没有水气的离心管，毕竟回收过程没有无菌操作，污染杂菌可能会影响后续的转化步骤）在吸附膜中央加入40 μL预热后的无菌水，在金属浴中静置2 min，9,000 × g离心1 min。将所得到的质粒DNA 溶液置于-20 ℃保存或用于后续试验。

加入预热的无菌水时注意要将水垂直加到吸附膜中央，不要直接加到吸附柱壁上，不然只有部分膜被水洗脱，会降低回收率

Check Lists

• 使用的试剂盒是什么____
• Wash Solution是否打钩(加入乙醇)____
• DNA样品的信息____
• 使用的洗脱液是什么____
• 洗脱液的体积____
• 回收的DNA的浓度____