样本如何准确的稀释定量

所有实验方案都会不断更新调整，请及时登录网站查看最新版本
原创内容，欢迎转载，转载请注明出处

主笔：于浩

注意事项

• 实验室做做实验需要加内标，测了几次之后发现内标总是不稳定，询问和查看实验记录才知道“用2.5 μL的移液枪“准确吸取”了1.35 μL的内标进行稀释”。我认为没有使用正确的稀释定量方法是导致内标不准确的主要原因。
• 我查了一下资料，没有找到权威的稀释定量方法，所以这里写的只是我个人的理解。由于移液枪不同，操作人员不同，稀释对象的理化性质不同，最终结果肯定会有差异。
• 首先要明白的就是什么情况下一定要进行准确稀释定量？每个实验都有自己相应的定量标准，如果只是为了提取质粒，那么配置的LB培养基是否准确，体积多少基本上都不会影响太大。但是如果要做标准曲线，那么每瓶的培养基的量就必须要准确。所以首先要清楚的就是，定量实验相对于定性实验对于精度要求更高。关于每个具体的定量实验，也首先要清楚哪一个成分，或者哪几个成分的定量是最关键的。比如说做qPCR，模板必须要准确定量；做色谱或者MS检测，内标的量以及内标和样本的比值必须准确；做酶活测定，酶的量必须准确。但是每个体系里面也有一些成分的量影响会小一些，比如说内标定量法中总样品量，qPCR中的引物的浓度，酶活测定中辅因子的浓度。当然所有成分一定是越准确越好。所以要综合成本、可行性来做决定。
• 这里写的方法也不是完全准确的，需要在后续实验中不断完善，欢迎大家多回复提取宝贵意见。

如何准确梯度稀释

1、准确进行梯度稀释之前要做好“混匀” “离心” “防挥发”三件事，初始溶液需要混匀，如果没有融化要等融化之后再混匀，混匀的溶液需要短暂离心离心到底部，防止吸液体的时候挂壁，稀释过程要快速，防止挥发或者蒸发，尤其是挥发性溶液。

2、现在的移液枪越来越准确了，高级的长吸头更不容易挂壁，更不容易挥发，在进行液体吸取的时候更为准确。但是考虑到大部分情况下我们使用的都是最普通的常规吸头，因此我们需要尽可能保证操作不受这些因素的影响。

3、移液枪应该默认是准确的，大龙的移液枪跟进口移液枪的准确度都可以满足我们的需求，绝大部分情况下移液枪导致的不准确要远远小于其他因素。如果不经常较枪，即使是最贵的移液枪也不一定能够保持准确。吸液时，要确保移液器垂直且吸头浸没尽量浅一些，一般来说枪头到页面以下2-3 mm比较合适，枪头越大浸没深度越深，灵活掌握。

4、放液时，吸头尖端靠在容器内壁（特别是对于20 μL 以下的体积），移液器角度 20° - 45°。体积低于 10 μL 直接放液到容器底部。吸液和放液时务必要慢吸慢放，以免液体进入吸头过快而冲入到移液器内部腐蚀活塞。

5、同一把移液枪最好用高量程来进行移液，尤其是10 μL量程的移液枪。也就是说在用10 μL移液枪的时候如果吸取的液体的量能够大于5 μL（样本不是特别珍贵）那么最好大于5 μL，同样的道理200 μL的移液枪最好量取的体积要尽量大于40 μL，否则还不如用小移液枪多量几次。

6、用一把移液枪进行稀释的准确度往往要比多把移液枪准确，比如说用同一把移液枪进行稀释，每次稀释5倍，那么可以将200 μL的液体加入到800 μL的稀释溶液中，这个时候用同一把移液枪的200 μL就要比用另一把的200 μL的移液枪好。

7、多次移液并不会不准确，如果每次稀释5倍，稀释3次可以稀释到125倍，也可以每次稀释10倍，2次就可以稀释到100倍，我认为用同一把移液枪准确操作的情况下，以上两种情况并不会差异很大。第一种方式操作麻烦一点，但是波动会更小一些，推荐。当然要综合考虑样本的珍贵程度来进行稀释。如果要稀释十万倍以上，最好每次稀释10倍甚至更高的倍数。

8、如果稀释的溶液为挥发性的，比如说醇、醛等，或者说稀释的溶液非常昂贵，比如说NADH或者NADPH，那么最好大倍数稀释（比如说每次稀释100倍）。

9、相反如果稀释的是不容易挥发的，比较经济的试剂可以适当稀释的梯度小一些。比如稀释刚果红染料或者葡萄糖溶液，就可以每次稀释10倍。

几个用于测试的小例子

[还在整理中，敬请期待]