Trizol法提取总RNA+反转录

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主笔：于浩、张晨晓

Trizol法提取RNA

说明

本方法为利用RNA提取液（Trizol等）进行真菌菌丝RNA提取的方法。
如果有”真菌RNA提取试剂盒“或者”植物RNA提取试剂盒“，也可以按照说明书中的方法使用试剂盒进行RNA提取，最后洗脱后分装成10 μL/管，于-80℃冻存。
所有RNA提取用的耗材都是专门准备的，放在专门的柜子里面，枪头都采用无菌无酶的带滤芯的枪头，大家使用的时候尽可能分装使用，用多少分装多少，无菌操作不是关键，关键是防止空气中和人体的RNA酶不要污染试剂耗材。
RNA提取尽量选择一个干净的地方进行操作，干净整洁比无菌更为重要，超净台里面尽量整洁，充分灭菌后操作过程中不要开无菌风。
操作过程要迅速，即使在没有超净台的情况下，只要操作熟练迅速也可以提取出高质量的RNA用于后续的cDNA合成。
RNA不要长期保存，现用现提。

一、实验准备

1、RNA提取试剂：公用冰箱4℃ Takara公司的RNAiso Plus（货号：9108-2）或者Vazyme公司的RNA isolater Total RNA Extraction Reagent（货号：R401-01）

2、其他试剂：氯仿、异丙醇、无水乙醇或95%乙醇（提取RNA的有机溶剂需要放在专门的柜子里面，不要与其他实验混用）

3、1.5 mL离心管、200 μL PCR管（均事先进行灭菌或者成品的无酶无菌管）、研钵、药匙（均进行灭菌）、1 mL带滤芯枪头、200 μL带滤芯枪头、10 μL带滤芯枪头。

4、无酶无菌水（公司购买）或自己配制的DEPC水

5、冷冻离心机、超净工作台、超微量分光光度计、-20℃冰箱

6、冰盒多个、液氮、乙腈手套、口罩

二、注意事项

每个步骤都要更换枪头，千万不要造成污染。
研钵、研杵及药匙（铁）用铝箔纸包裹灭菌，带滤芯的枪头在超净工作台中分装后灭菌，1.5 mL离心管和200 μL PCR管用菌袋或者组培瓶装后灭菌。
超净工作台用前用75%酒精喷洒，紫外处理半小时及以上后使用，使用时每次从外界重新进入超净工作台时，用酒精喷洒超净工作台操作侧周围。
所有试剂均在使用前预冷（放在冰箱中或放于冰上），使用时均放在冰盒中提前置于超净工作台中紫外处理30 min。
操作过程中要全程佩戴口罩、手套，穿戴实验服，尽量不要让自己的皮肤暴露。
冷冻离心机要提前预冷，实验尽量全程在冰上操作，实验在超净工作台中进行。
进行跑胶验证时，RNA需稀释至500 ng/μL左右，且配置凝胶和进行跑胶的缓冲液最好用新的。

三、实验步骤

1、称取0.2 g样品（不少于0.2g）至1.5 mL离心管中，迅速置液氮中速冻。

2、将研钵置于液氮中，预冷后取出，加入液氮迅速磨样（可以先捣碎样品，再进行研磨），研磨期间要不断补充液氮，防止样品融化。磨成细粉后用药匙挂取到无RNase的1.5 mL离心管中（药匙和离心管均在液氮中提前预冷），做好标记后放入液氮中，待全部样品磨好后，向离心管中加入1 mL RNA提取试剂（冰上提前冷却），用手将底部粉末弹起与试剂充分混合（也可涡旋混匀），冰上静置5 min。

3、12000 rpm，4℃离心11 min，取上清（不要吸到沉淀，最多800 μL）于新的无RNase的离心管中，向上清中加入200 μL氯仿（冰上提前冷却），颠倒混匀约60下（呈粉白色），冰上静置直至分层（上层乳白，下层粉紫）。

4、12000 rpm，4℃离心11 min，轻轻拿出离心管。在超净工作台中取上清（一般最多400 μL）于一个新的无RNase离心管中，注意不要吸到中间蛋白层，加入等体积异丙醇（冰上提前冷却），轻柔颠倒混匀。

5、-20℃静置30 min，沉淀RNA。

6、12000 rpm，4℃离心11 min，此时会出现白色沉淀，在超净工作台中弃上清。

7、加入900 μL 75%乙醇（现配现用，冰上提前冷却），将沉淀轻轻吹起，12000 rpm，4℃离心5min，弃上清，注意不要倒走沉淀。

1.58 mL 95%乙醇 + 1.42 mL DEPC水可以配置成75%乙醇。

8、重复步骤7一次，注意这次用枪头将上清吸出。

9、短暂离心，用10 μL枪头吸干管底乙醇，注意不要吸到沉淀，将离心管置于超净工作台中吹5 min。

10、加入40 μL预冷的无RNA酶的H2O（若沉淀较少可加20 μL），用枪轻轻吸打混匀使沉淀充分溶解，待完全溶解后分装成10 μL/管，于-80℃冻存。

必须分装，因为反复冻融RNA会迅速分解，即使使用试剂盒进行提取，这一步也要分装10 μL/管。

11、取其中的10 μL进行agarose凝胶电泳（最好专门找一个小电泳槽，电泳要快速，短期内RNA不会被降解），在电泳前，利用紫外分光光度计测浓度、纯度（需要跑胶验证），浓度以电泳为准，跟之前的结果比较估算。

图1 RNA凝胶电泳图

RNA即使在-80℃冰箱保存也不稳定，因此必须要尽快使用，在电泳和测定浓度都没有问题的情况下尽快反转录为cDNA，cDNA如果短期不用可以放到-80℃冰箱保存。

四、说明书步骤

实验记录

反转录生成cDNA

说明

反转录采用试剂盒来
RNA提取后要尽快进行反转录操作，最好在agarose电泳之后马上进行反转录操作。
具体操作步骤按照试剂盒的流程进行就行，一定要保持洁净，注意全程保持低温，用完后尽快把试剂盒放回冰箱。保证及时更换吸头，避免污染。

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