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主笔:于浩、张晨晓
Trizol法提取RNA
说明
- 本方法为利用RNA提取液(Trizol等)进行真菌菌丝RNA提取的方法。
- 如果有”真菌RNA提取试剂盒“或者”植物RNA提取试剂盒“,也可以按照说明书中的方法使用试剂盒进行RNA提取,最后洗脱后分装成10 μL/管,于-80℃冻存。
- 所有RNA提取用的耗材都是专门准备的,放在专门的柜子里面,枪头都采用无菌无酶的带滤芯的枪头,大家使用的时候尽可能分装使用,用多少分装多少,无菌操作不是关键,关键是防止空气中和人体的RNA酶不要污染试剂耗材。
- RNA提取尽量选择一个干净的地方进行操作,干净整洁比无菌更为重要,超净台里面尽量整洁,充分灭菌后操作过程中不要开无菌风。
- 操作过程要迅速,即使在没有超净台的情况下,只要操作熟练迅速也可以提取出高质量的RNA用于后续的cDNA合成。
- RNA不要长期保存,现用现提。
一、实验准备
1、RNA提取试剂:公用冰箱4℃ Takara公司的RNAiso Plus(货号:9108-2)或者Vazyme公司的RNA isolater Total RNA Extraction Reagent(货号:R401-01)
2、其他试剂:氯仿、异丙醇、无水乙醇或95%乙醇(提取RNA的有机溶剂需要放在专门的柜子里面,不要与其他实验混用)
3、1.5 mL离心管、200 μL PCR管(均事先进行灭菌或者成品的无酶无菌管)、研钵、药匙(均进行灭菌)、1 mL带滤芯枪头、200 μL带滤芯枪头、10 μL带滤芯枪头。
4、无酶无菌水(公司购买)或自己配制的DEPC水
5、冷冻离心机、超净工作台、超微量分光光度计、-20℃冰箱
6、冰盒多个、液氮、乙腈手套、口罩
二、注意事项
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每个步骤都要更换枪头,千万不要造成污染。
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研钵、研杵及药匙(铁)用铝箔纸包裹灭菌,带滤芯的枪头在超净工作台中分装后灭菌,1.5 mL离心管和200 μL PCR管用菌袋或者组培瓶装后灭菌。
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超净工作台用前用75%酒精喷洒,紫外处理半小时及以上后使用,使用时每次从外界重新进入超净工作台时,用酒精喷洒超净工作台操作侧周围。
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所有试剂均在使用前预冷(放在冰箱中或放于冰上),使用时均放在冰盒中提前置于超净工作台中紫外处理30 min。
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操作过程中要全程佩戴口罩、手套,穿戴实验服,尽量不要让自己的皮肤暴露。
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冷冻离心机要提前预冷,实验尽量全程在冰上操作,实验在超净工作台中进行。
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进行跑胶验证时,RNA需稀释至500 ng/μL左右,且配置凝胶和进行跑胶的缓冲液最好用新的。
三、实验步骤
1、称取0.2 g样品(不少于0.2g)至1.5 mL离心管中,迅速置液氮中速冻。
2、将研钵置于液氮中,预冷后取出,加入液氮迅速磨样(可以先捣碎样品,再进行研磨),研磨期间要不断补充液氮,防止样品融化。磨成细粉后用药匙挂取到无RNase的1.5 mL离心管中(药匙和离心管均在液氮中提前预冷),做好标记后放入液氮中,待全部样品磨好后,向离心管中加入1 mL RNA提取试剂(冰上提前冷却),用手将底部粉末弹起与试剂充分混合(也可涡旋混匀),冰上静置5 min。
3、12000 rpm,4℃离心11 min,取上清(不要吸到沉淀,最多800 μL)于新的无RNase的离心管中,向上清中加入200 μL氯仿(冰上提前冷却),颠倒混匀约60下(呈粉白色),冰上静置直至分层(上层乳白,下层粉紫)。
4、12000 rpm,4℃离心11 min,轻轻拿出离心管。在超净工作台中取上清(一般最多400 μL)于一个新的无RNase离心管中,注意不要吸到中间蛋白层,加入等体积异丙醇(冰上提前冷却),轻柔颠倒混匀。
5、-20℃静置30 min,沉淀RNA。
6、12000 rpm,4℃离心11 min,此时会出现白色沉淀,在超净工作台中弃上清。
7、加入900 μL 75%乙醇(现配现用,冰上提前冷却),将沉淀轻轻吹起,12000 rpm,4℃离心5min,弃上清,注意不要倒走沉淀。
1.58 mL 95%乙醇 + 1.42 mL DEPC水可以配置成75%乙醇。
8、重复步骤7一次,注意这次用枪头将上清吸出。
9、短暂离心,用10 μL枪头吸干管底乙醇,注意不要吸到沉淀,将离心管置于超净工作台中吹5 min。
10、加入40 μL预冷的无RNA酶的H2O(若沉淀较少可加20 μL),用枪轻轻吸打混匀使沉淀充分溶解,待完全溶解后分装成10 μL/管,于-80℃冻存。
必须分装,因为反复冻融RNA会迅速分解,即使使用试剂盒进行提取,这一步也要分装10 μL/管。
11、取其中的10 μL进行agarose凝胶电泳(最好专门找一个小电泳槽,电泳要快速,短期内RNA不会被降解),在电泳前,利用紫外分光光度计测浓度、纯度(需要跑胶验证),浓度以电泳为准,跟之前的结果比较估算。
图1 RNA凝胶电泳图
RNA即使在-80℃冰箱保存也不稳定,因此必须要尽快使用,在电泳和测定浓度都没有问题的情况下尽快反转录为cDNA,cDNA如果短期不用可以放到-80℃冰箱保存。
四、说明书步骤
实验记录
- 样本信息____
- 样本重量____
- 提取时间____
- nanodrop测定浓度____
- 是否进行琼脂糖电泳____
反转录生成cDNA
说明
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反转录采用试剂盒来
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RNA提取后要尽快进行反转录操作,最好在agarose电泳之后马上进行反转录操作。
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具体操作步骤按照试剂盒的流程进行就行,一定要保持洁净,注意全程保持低温,用完后尽快把试剂盒放回冰箱。保证及时更换吸头,避免污染。
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