一、实验准备
1、LB培养基（划平板和预实验的培养基可以使用统一配置的LB培养基，大量蛋白纯化请自己配置LB培养基）
2、IPTG可以到公共冰箱取用，用多少拿多少，用不完自己放到-20℃保存，不要放回去。如果公共的IPTG用完了，请及时配置，具体配置方法参考：低温保藏溶液配置方法
3、1 M咪唑溶液在公共区域，可以利用自己的缓冲液稀释后使用，用多少配多少，储藏液用完后及时配置，具体方法参考：常见溶液、缓冲液配置方法
4、三角瓶、离心管、全温摇床、超声波破碎仪、超净台、恒温培养箱、离心机、冰箱等。
二、注意事项
1、每次都要从单菌落开始，划单菌落参考教程：微生物菌株分离
2、常用的诱导温度为16℃，低温可以防止包涵体的形成，如果30℃诱导不会形成包涵体可以使用30℃诱导。
3、使用超声波破碎仪一定要在使用后把超声探头清洗干净。
三、实验步骤
1、用灭菌枪头挑取1个单菌落，加入到含有合适的抗生素的10 mL LB液体培养基（统一配置）中，于37℃摇床充分振荡培养过夜作为种子培养基。
阴性对照：再接种重组菌株的同时，要对含有空载体的大肠杆菌（菌种在公共冰箱）进行活化，并进行划线，按照样品同样的方法进行蛋白诱导表达。
具体的质粒与抗生素对应关系请查看下面的连接：常用质粒抗性
2、接种1~2%（v/v）的新鲜的种子到新鲜的LB培养基中。
第一次做可以用统一配置的50 mL的LB进行实验，大量纯化自己配置LB培养基。
用来进行蛋白诱导表达的LB培养基装液量为20%。也就是说500 mL的瓶子装200 mL LB培养基。
3、将接种后的三角瓶放到37℃摇床进行培养，期间不时取出观察菌株生长情况。如果看到略微变浑浊可以取出测定OD600。
注：如果做多瓶平行实验，只取出一瓶测定OD600即可。
4、如果OD600到达0.5~0.7区间的时候，可以加入0.5 mM IPTG。
一般配置的IPTG为1 M，200 mL中加入100 微升。
0.5 mM浓度已经很高了，如果蛋白没有表达，通过增加IPTG浓度不会增加蛋白表达。
如果诱导蛋白表达量非常高，可以适度降低IPTG浓度至0.1-0.2 mM，保证蛋白适量表达，正确折叠。
5、将接种后的培养物放到16℃/30℃进行培养过夜。
低温表达可以降低大肠杆菌蛋白诱导表达的速率，从而使得表达出来的蛋白能够正确折叠保持活性，因此16℃是我们常用的表达温度。
如果是第一次进行诱导表达，也可以尝试30℃进行诱导表达，先保证能够诱导出来，再改变诱导条件增加酶的活性。
温度低有利于酶保持酶活，有利于减少包涵体的数量，但是菌体生长速度比较慢。
6、培养完成，离心收集菌体。8000 rpm离心5 min（或者其他条件离心），离心后用缓冲液洗涤一遍，再用破碎缓冲液悬浮，将菌体进行超声波破碎。
大肠杆菌表达的蛋白没有信号肽，如果蛋白自己没有携带信号肽，都是胞内蛋白。
如果添加信号肽进行胞外蛋白表达则需要离心后保存上清，利用色谱纯化或者硫酸铵沉淀等方式获得蛋白。
超声波破碎条件，破碎3 s；停6 s；总时间30 min（有效时间10 min）；功率400左右。
7、破碎后的菌体进行离心，8,000~10,000 rpm离心5~10 min。将上清小心转移到新的离心管中，注意不要转移出沉淀。
8、纯化后的蛋白通常要进行（1）SDS-PAGE检测实验材料与阴性对照的蛋白表达是否存在差异；（2）测定实验材料与阴性对照的活性。
9、如果蛋白表达切有活性，就要进行蛋白纯化（参考：His-tag重力柱纯化带有His标签的蛋白），不要保存粗酶液。
实验记录
- 是否从单菌落开始____
- 质粒名字____，抗生素种类____
- IPTG诱导浓度____
- 加入IPTG时大肠杆菌的OD600值____
- 诱导温度____
- 诱导时间____
- 细胞破碎方法____
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