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大肠杆菌超级感受态细胞热激转化方法

食用菌精准育种实验室-实验宝典
2023-10-25 / 0 评论 / 0 点赞 / 589 阅读 / 711 字

主笔:姚型东,于浩

参考:感受态说明书


注意事项

1、实验室转化实验不多建议直接购买生物公司制作的超级感受态细胞,当然也可以自己制作感受态细胞,自制的超级感受态细胞使用前一定要测定转化效率,最好是跟商业化的感受态细胞一起比较确定转化效率。

2、要严格按照无菌操作进行实验,防止污染出现假阳性。

3、感受态细胞与重组质粒或混合液混匀时一定要轻轻拨弄离心管,不能吸打混匀和震荡混匀。


一、实验准备

1、大肠杆菌感受态细胞(DH5α等)(公司购买,或者自制的超级感受态细胞),待转化DNA;

2、LB平板(含抗性)、LB液体培养基(-20℃分装好的1 mL);

3、1 mL枪头,10 µL枪头,移液枪,冰盒,涂布棒。

4、恒温水浴锅,超净工作台。


二、实验步骤

1、感受态细胞于冰上自然解冻(5-10 min),待转化DNA于冰上提前预冷(解冻),从冰箱中取出装有1 mL LB培养基的离心管,放到37℃培养箱中预热;

如使用已经准备好的平板,需要在37℃培养箱中预热

2、取待转化DNA(不要超过10 µL)于100 µL感受态细胞中,轻轻拨弄混匀(一定要充分混匀),冰上静置30 min;

2、42℃水浴热激90s后,立即置于冰上静置2-3 min;

整个过程要保证不要剧烈震荡,如使用循环水浴锅进行热激转化,务必关掉循环水。

3、于超净工作台中加入37℃预热后的900 µL LB液体培养基(不添加抗生素),37℃摇床震荡恢复1 h(~150 rpm/min);

4、在恢复培养的时间倒平板(加入相应抗生素),对玻璃棒进行灼烧灭菌;

5、5000 rpm离心5 min,于超净工作台中弃上清,离心管中保留~100 µL液体,利用残留的液体重悬菌体;

重悬过程要轻吸慢打,不能剧烈吸打,防止污染。

6、将重悬菌液吸取至LB平板中央,使用灭菌后的玻璃棒轻轻涂匀;


实验报告

  • 感受态细胞____

  • 外源DNA是什么____

  • 使用的载体是什么____,抗生素种类和加入量____

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